第五章定殖规律研究 - yzxzcom.doc

第五章 JK-2、H4-3定殖规律研究 植物病害生物防治是实现农业可持续发展的重要措施。已经有许多研究证实能够成功防治植物土传病害的生防细菌具备以下特性：能够在寄主植物上病菌侵染的位点存活、定殖，建立起稳定的群体；能够产生对病原菌有抑制作用的化学物质；菌体细胞本身及(或)其代谢产物可以诱发寄主对病原菌的抗性（Handelsman and Stabb,1996）。多年以来，一直困惑着植物病害生防效果的问题就是生防的稳定性．应该说生防稳定性受到许多因子的影响，是一个十分复杂的问题，它涉及到生防制剂本身、病原生物、寄主植物和环境因子。由于植物生防细菌应用效果的不稳定性，近30年来，在国内外的商品化进程中受到很大程度限制。 研究并揭示具有生防及促生作用的有益微生物在自然界中的生态分布以及在植物体表和体内的定殖、扩展和分布规律，是阐明其生防及促生作用机制并提高作用效果的重要方面，对提高和稳定菌剂的生防效果、制定科学的施用技术具有重要意义。引入的生防菌在根部定殖能力的强弱决定着生防的成功与失败，因此，植物生防细菌在植物根际的定殖微生态研究是近10多年来人们关注的重点。传统的抗生素标记及放射性同位素标记等技术手段难以直观地区分土著微生物和人工接种微生物，并且出于安全性方面的考虑，对其使用具有一定的局限性（Errampalli D，1999）。发光基因标记技术的出现为实时、原位监测微生物在环境中的生态分布以及研究微生物和宿主间相互作用机制等提供了一种灵敏可靠的研究方法（Qazi S N A，2001）。发光标记系统等现代基因标记技术的兴起，为探明拮抗细菌的根围定殖动态提供了有效的研究手段。绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)标记系统具有标记基因小 (约800bp)，直接肉眼检测荧光、对细胞安全、稳定等优点 (Chalfie M，1994)，已被成功用于微生物定殖（Gage D J，1994）、对宿主组织侵染（陈营，1999）、微生物动态监测（Zhao H，1998）、基因表达调控（Chris D，1995）等研究。本研究拟用绿色荧光蛋白报告（gfp）基因标记示踪，检测JK-2菌株在根部环境的种群动态，以进一步评价自然状况下JK-2菌株的定殖能力。 5.1.1 材料与方法 5.1.1.1 材料 短芽孢杆菌JK-2菌株由本研究室分离保存。质粒PCM20由瑞典斯德哥尔摩南方大学Janet Jansson教授惠赠，其中带有红霉素（Erm）抗性基因和gfp基因。质粒大量提取及纯化试剂盒为德国QIAGEN公司的QIAGEN Plasmid Maxiprep Kit；红霉素购自Sigma公司；电转化仪为美国BTX公司生产的ECM-600 Model Electroporation System；蛋白胨为上海生工BBI公司产品，酵母抽提物为OXOID公司产品；Leica MZ12 FL Ⅲ立体荧光显微镜；OLYMPUS荧光显微镜；蓝盾621可见光凝胶透射仪。供试番茄品种为上海903。 5.1.1.2 质粒提取方法 挑取紫外灯下发绿色荧光的质粒宿主菌的单菌落于10 ml 含100 μg/ml A Erm的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。根据说明书用质粒纯化试剂盒提取质粒。提取的质粒用0.8％琼脂糖电泳检测纯度。 5.1.1.3 JK-2感受态细胞的制备 在LB液体中摇床震荡培养JK-2至OD600为0.6，取菌液冰浴10 min，8000 r/min 4℃离心收集菌体。冰预冷的无菌水洗菌体四次，最后将菌体重悬于10％甘油中，-70℃冰箱保存备用。 5.1.1.4电击转化 2mm电转化杯冰上预冷后，分别加入200 μL 感受态细胞和50ng质粒，冰浴10 min后进行电击转化，电击条件为2.5 kv ，200 Ω，25 μF。电击结束立即加入800 μL的LB培养基，混匀并转入1.5 ml的Eppendorf管中，于37℃、120 r/min的摇床上振荡培养2 h，取适量菌液涂布在含有10 μg/mL Erm的LB培养基上，37℃培养至长出单菌落。 5.1.1.5 转化子的荧光检测 将含有Erm的LB平板置于立体荧光显微镜下，立体荧光显微镜所用激发光滤片为480 nm，阻档滤片为LP 510 nm，通过观察菌落发出的绿色荧光直接筛选阳性转化子。用接种环挑取适量JK-2-gfp，常规制片，荧光显微镜观察、拍照。 5.1.1.6 标记菌株遗传稳定性的测定 过夜活化JK-2-gfp，培养好的液体种子用新鲜的LB液体培养基洗去抗生素后，将菌体悬浮在等体积的LB培养基中，然后按1％(V/V)的接种量接种到无抗生素的LB培养基中，250 ml三角瓶装液量25ml、37℃、170 r/min培养6h。其后每6 h转接入新的同型摇瓶，