中国生命科学论坛精华--蛋白质实验-生物谷.PDF

中国生命科学论坛精华之—— 蛋白质实验（1） 蛋白质的研究是现在生物学领域的一个主要的研究方向。现在我们把来自中国生命科学论坛的 部分精华帖子整理出来，与大家共同讨论。希望对大家都有所帮助。同时欢迎您来到 。 一、蛋白质提取 1、植物组织蛋白质提取方法 （summer） 1、根据样品重量（1g 样品加入3.5ml 提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。 2 、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4 小时）。 3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃ 4 、提取上清液，样品制备完成。 蛋白质提取液：300ml 1、1M tris -HCl （PH8 ） 45ml 2 、甘油（Glycerol）75ml 3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone ）6g 这种方法针对SDS，垂直板电泳！ 2 、植物组织蛋白质提取方法 (summer) 三氯醋酸—丙酮沉淀法 1、在液氮中研磨叶片 2 、加入样品体积3 倍的提取液在-20 ℃的条件下过夜，然后离心（4 ℃8000rpm 以上1 小时）弃上清。 3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07% 的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4 ℃8000rpm 以上1 小时），然 后真空干燥沉淀，备用。 4 、上样前加入裂解液，室温放置30 分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm 以 上 1 小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4 ℃待用。 5、用Brandford 法定量蛋白 （见第二部分），然后可分装放入-80℃备用。 药品： 提取液：含 10%TCA 和0.07% 的β-巯基乙醇的丙酮 裂解液：2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M 的 DTT65ul/ml。 这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带 会减少！ 3 、肠黏膜组织蛋白质提取方法 （newinbio ） 目的：WESTERN BLOT 检测凋亡相关蛋白的表达 应用TRIPURE 提取蛋白质步骤： 含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml 每 1mlTRIPURE 用量） 倒转混匀，置室温 10min 离心：12000 g，10min，4 度，弃上清 加入0.3M 盐酸胍/95 ％乙醇：（2ml 每 1mlTRIPURE 用量） 振荡，置室温20min 离心： 7500g ，5 min ，4 度，弃上清 重复0.3M 盐酸胍/95 ％乙醇步2 次 第 1 页 共 10 页 中国生命科学论坛精华之—— 蛋白质实验（1） 沉淀中加入 100％乙醇 2ml 充分振荡混匀，置室温20 min 离心： 7500g ，5min ，4 度，弃上清吹干沉淀 1％SDS 溶解沉淀 离心：10000g，10min，4 度 取上清-20 度保存（或可直接用于WESTERN BLOT ） 存在的问题：加入 1％SDS 后沉淀不溶解，还是很大的一块，4 度离心后又多了白色沉定，SDS 结晶？ 测浓度，含量才 1mg/ml 左右。 解决：提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加2X BUFFER ，然后煮5－10 分钟，效果很 好的。 4 、植物蛋白提取 （yog ） Protein extraction buffer (Camiolo buffer): 100 ml= (0.075M Potassium Acetate) 0.736g (0.3M) NaCl 1.753g (0.1M) L-arginine basic salt 1.742g (0.01M) EDTA-HCl 0.292g (0.25%) Triton X- 100 250. ul up to 100 ml with dH20. pH 7.4. Then 0.2 um filter. 步骤： 1. Freeze tissue in liquid nitrogen. 2. Rinse in PBS then mince. 3. Add 1 ml Camiolo extraction buffer per 100 mg of tissue. 4. Homogenize for 1 minute at 4C. 5.