兔眼IPE和RPE细胞膜的K-NPPase酶组织化学的电镜图像分析.pdfVIP

中文摘要 前 言 ／ ＼＼(虹膜色素上皮(IPE)细胞与视网膜色素上皮(RPE)细 胞具有相同的胚胎发育来源，基本具备RPE细胞的生理功能， 且取材方便，可望代替RPE细胞实现自体移植，治疗老年性 黄斑变性(ARMD)等疾病。近年来，国内外学者围绕构建光 感受器复合体所需要的RPE细胞的四项生理功能进行大量研 究，在IPE细胞和RPE细胞之间进行了大量的比较研究，研 究表明在摄取、储存和代谢维生素A、吞噬视杆细胞外节盘膜 (ROS)、分泌细胞外问质的多种细胞因子这三个方面，IPE 细胞与RPE细胞有许多相似之处，可以代替RPE。但是在物 质转运功能方面对RPE和IPE细胞比较研究较少。正常物质 转运功能是细胞行使其它生理功能的前提与基础，在IPE细胞 和RPE细胞之间进行物质转运功能的比较对IPE能否代替 RPE移植具有重要意义。 在物质转运功能中，Na+，K+-ATPase是细胞进行物质转运 的原动力，在不同的组织，其表达和分布有很大差异。RPE细 (ROS)衔接处的微绒毛膜上密度最高，与电解质，氨基酸， 葡萄糖，水等物质在视网膜和脉络膜之间的转运密切相关；IPE 细胞的Na+，K+-ATPase分布尚未见报道。本实验中钾依赖性对 性脱磷酸反应的部分，它的活性与Na+，K+-ATPase活性密切相 、+、／ 犬。) 目 的 本研究采用K．NPPase酶组织化学技术，对兔眼IPE细胞 像分析系统对电镜图像中K．NPPase组化颗粒进行定量分析比 较，比较IPE细胞与RPE细胞膜上Na+，K+-ATPase的分布情况， 为IPE细胞在物质转运方面能否代替RPE细胞行使功能提供 理论依据。 材料与方法 1．实验动物：选择健康有色素家兔与无色素(白色)家 兔各6只，共12只(由中国医科大学实验动物部提供)，体重 2．5-3．oI,：g，平均兔龄6个月，雌雄不限。分组设计为有色素组 12只眼和无色素组12只眼；有色素组和无色素组又分别分为 IPE组和RPE组各12例，在组与组之间进行交叉比较，最后 进行总的IPE组和RPE组的比较。 2．标本制作：耳缘静脉注射5．0ml空气处死后，无菌操作 下摘取家兔双眼球。用4％多聚甲醛和0．5％戊二醛混合液(含 6％蔗糖)球内灌注及浸泡固定，4。C，45分钟，将组织切成 2rnm×4mm的薄块。 3．K．NPPase酶组化孵育液配制： a．于1mol／L甘氨酸一KOH缓冲液(pH=9．0)中加入左旋 ·，． 2．5ml。 慢滴入DMS0 4．0mmol／L浓度的溶液，摇匀使之溶解。 c．将b步骤所配制的枸橼酸铅一KOH溶液缓慢滴入a步 骤所配制的溶液中，最终孵育液呈半透明微绿色。 4．K．NPPase酶组化孵育：将组织薄块浸入孵育液，置于 37℃温箱中，孵育40～50min。 5．电镜观察：将孵育后的组织薄块用100mmol／L二甲肿 中固定30min：用100M二甲胂酸缓冲液冲洗两次，各5分钟； 依次用50％．70％．80％．90％．95％一100％浓度酒精梯度脱水，各 浸透、包埋、聚合；切半薄切片后在光镜下定位，修块；超薄 切片700A，醋酸双氧铀电子染色10分钟，烘干；电镜观察， 拍照。 ／、 、 照片。随机选取IPE细胞膜上K—NPPase的阳性颗粒以及RPE 细胞顶端和ROS相接的微绒毛上的阳性颗粒相邻两点问的距 离进行测量。计算每例样本的均值±标准差(叉±s)(95％可 信区间)，通过t检验进行统计学分析，分别对有色素组和无 色素组的IPE组与RPE组数据进行比较，最后再对总的IPE 组和RPE组数据进行比较。 结 果 电镜观察：IPE细胞膜与RPE细胞顶端微绒毛膜上均可见 K．NPPase颗粒沉积。 有色素组IPE组与RPE组K—NPPase沉积颗粒间距离经统 计学比较无显著性差异，0．5P0．2；无色素组IPE组与RPE 组K．NPPase沉积颗粒间距