抗生素配制.doc

轉殖阿拉伯芥篩選 抗生素配製 培養基配製 種子的保存 消毒種子 播種及栽培 抗生素配製 1. 常用抗生素篩選濃度：kanamycin，50mg/l；hygromycin，20mg/l；vancomycin，500mg/l；Timentin，20-200mg/l 2. 抗生素配製方式： a. 秤取500mg kanamycin （sigma k-4378）溶於水中，總體積調成10ml，配成1000倍之stock（濃度為50mg/ml）。以0.2μm filter 過濾消毒後，將溶液置於滅過菌的eppendorf tube 中。存於-20℃冰箱備用。 b. hygromycin （向萬造購買hygromycin B，濃度為100mg/ml）為5000倍之stock。 c. 秤取2g timentin（Duchefa T0190）溶於水中，總體積調成10ml配成1000倍之stock（濃度為200mg/ml）。以0.2μm filter 過濾消毒後，將溶液置於滅過菌的eppendorf tube 中。存於-20℃冰箱備用。（註一） 培養基配製 以配製500 ml media 為例：秤取1.075 MS salt（JRH cat. no. 56740）＋ 5g sucrose（sigma s-8501）pH = 5.7，定量至500ml + 4g Bacto Agar（DIFCO），autoclave（121℃，1.1kg/cm2）20 min。待media 冷卻至60-65℃左右（約可徒手拿起的溫度），加入抗生素（50mg/ml kanamycin 0.5ml或100mg/ml hygromycin 0.1ml，200mg/ml timentin 0.05ml - 0.5ml ），抗生素需邊加邊搖，以確保均勻加入media中。倒入直徑15 cm 之petri dish，每個dish 約倒入60 ml media（或9 cm 之petri dish，每個dish 約倒入25 ml media）。冷卻凝固後置於4℃冰箱備用。 種子的保存 一般種子的保存方式為低溫乾燥，需注意保存空間的溫度及溼度，時間亦會影響種子的萌發率。 消毒種子 秤取適當數量的種子；若使用1.5ml eppendorf tube，種子的重量約10-30 mg/tube。 以70﹪酒精消毒，時間約1分鐘。 以1-2﹪NaOCl +0.1﹪tween -20（介面活性劑，使種子表面完全接觸液體）消毒10 -15 分鐘（註二），可置於vortex 上，低速震盪。 以1ml無菌水清洗至少5次左右，需將漂白水完全洗淨，避免影響種子萌發率。 將種子浸在無菌水中，置於4℃冰箱（打破休眠），2-4天後再播種。 播種及栽培 1.若將種子播於15 cm 直徑的plate 上時，加入8ml 0.1﹪agarose（需注意agarose的溫度不可過高），搖動培養皿使種子均勻分布於培養基上，靜置10-15分鐘。若要直接播種，可加入8ml 無菌水，搖動培養皿使種子均勻分布於培養基上，再吸去多餘的水。每個15 cm plate 可播1000-2000顆種子。 置於22-24℃，16hr /8hr（日/夜）之生長箱中，約一至二星期後可觀察篩選結果（使用抗生素篩選時，抗生素不會抑制種子萌發，常用的抗生素多半是抑制蛋白質合成，如kanamycin，因此播種後非轉殖株亦會發芽。非轉殖株經抗生素篩選，約一至二週後子葉或整株呈現白化現象；且只長出胚根即停止發育。因此轉殖株與非轉殖株最容易區別之處即在根的生長。） 若有reporter gene（如GUS）可取一些組織，檢測是否為轉殖株。 將轉殖株移至介質中（有機培養土:蛭石:珍珠石=10:1:1），以保鮮膜（戳幾個小孔）蓋住，置於22℃，16hr /8hr（日/夜）之生長箱中，約3-4天葉片已正常展開時，即可將保鮮膜去除。 註一、轉殖感染的過程，發生在種子發育前，因此經過農桿菌感染而收集到的種子中，很容易有表面消毒無法清除的農桿菌。在播種篩選時，加入Timentin，對種子萌發沒有影響，但可有效消除農桿菌污染的問題。 註二、一般市售漂白水約稀釋五倍；1 ml 漂白水 + 4 ml dd H2O + 5μl tween -20 ※轉殖室的轉殖率約2-3﹪