水飞蓟素可增加斑马鱼对铜离子的耐受度.doc

組蛋白乙醯轉移酶抑制劑1, 10-二氮雜菲對斑馬魚胚胎發育的影響 1蕭蓉禎、、溫育德 摘要(Abstract)：Histone acetyltransferase；HAT）與組蛋白去乙醯轉移酶參與基因轉錄作用的表現，並且在維持細胞正常的增生、生長與分化中扮演重要的角色。當HAT發生染色體易位、突變及在癌細胞中被不正常調控時，會導致疾病或癌症的產生。本實驗探討OP（1, 10-二氮雜菲；1, 10-Phenanthroline monohydrate）對斑馬魚胚胎發育之影響，結果發現隨著OP濃度的增加，斑馬魚胚胎死亡率也隨之增加，在8 microM OP的處理下，經過5天培養，幼魚存活率低於10%。此外我們也發現儘管低濃度的OP (1.2~2.0)不會造成胚胎顯著地的死亡，卻會延遲以及抑制幼魚孵化，這些無法孵化的胚胎最終也會死亡。由於OP具有螯合金屬離子的能力，我們發現當OP與Cu2+一起培養，即可改善OP所造成的胚胎孵化延遲現象。由於斑馬魚體型小、易於培養，未來可利用斑馬魚作為篩選組蛋白乙醯轉移酶抑制劑的實驗動物。 關鍵字：、1, 10-、、 前言 組蛋白乙醯轉移酶（Histone acetyltransferase；HAT）可分為A、B兩種類型： A型組蛋白乙醯轉移酶，主要位於細胞核，可以轉乙醯基於染色質的核仁小體組蛋白上，並且具有轉錄之調節作用。A型組蛋白乙醯轉移酶可更進一步分為五個家族，包括Gcn5-related acetyltransferases（GNATs）、p300/CBP、MYST、TBP-associated factorⅡ250（TAFⅡ250）、Nuclear receptor coactivators 及ATF2等家族（Allis et al., 1985）。B種類組蛋白乙醯轉移酶，具有管家（housekeeping）的角色，位於細胞質，B種類組蛋白乙醯轉移酶在細胞質中可乙醯化新合成的游離組蛋白，並將乙醯化的組蛋白運輸至細胞核，組蛋白經去乙醯化後再與DNA結合形成核仁小體。HAT有很多家族，同一家族的HAT，其胺基酸序列皆具有高度相似性，不同家族的HAT之間，除了都具有HAT domain之外，其結構也有很大的差異，以及胺基酸序列不具有高度的相似性（Kuo et al., 1998）。 銅離子可作為許多酵素（cytochromo c oxidase、Cu/Zn superoxide dismutase、ceruloplasmin和tryosinase）的輔因子，在in vivo中，過量的Cu2+會從原本的bound form轉變成free form，導致DNA、蛋白質和細胞的傷害，甚至造成一些疾病，如阿茲海默氏症、Wilson disease、糖尿病和癌症。Broday 等人發現過量的銅離子，會導致酵母菌細胞中的組蛋白乙醯化作用減少（Broday et al., 2000），並且在近來的研究中也發現，銅離子會直接抑制Hep3B細胞中HAT的活性，進而導致組蛋白低度乙醯化。在HL-60細胞，隨著銅離子濃度的增加，會使cell proliferation停止，並且隨著銅離子濃度的增加，也會增加氧化壓力進而抑制組蛋白乙醯化（Lin et al., 2005）。 OP是一個金屬螯合劑，可與銅形成OP-Cu2+，在還原劑以及氧分子存在時，OP-Cu2+具有nuclease活性。OP-Cu2+可結合到DNA的minor groove並且藉由銅的催化作用產生˙OH剪切DNA。OP也具有產生氫過氧化物，引起細胞傷害和DNA斷裂（fragmentation）、抗腫瘤、anti-Candida、anti-mycobacterial、anti-microbial的功能。在Hep3B細胞株中，經由OP-Cu2+ 與Ni2+所產生的ROS，以及Ni2+所產生細胞毒素和致癌性，皆會抑制細胞中組蛋白之乙醯化作用，然而在促進IL-8轉錄作用期間，ROS反而會增加組蛋白乙醯化作用的進行，因此組蛋白高度乙醯化時，ROS會促進proinflammatotry基因：IL-8的轉錄作用。已經有文獻證明，經in vivo與iv vitro實驗，OP在Cu2+、O2存有下時可促進ROS的產生以及引起細胞凋亡，而OP-Cu2+在Hep3B細胞株中，也會明顯促進ROS的產生，引起組蛋白低度乙醯化作用（Histone hypoacetylation）的生成，進而導致細胞凋亡（Kang et al., 2005 b），因此本實驗利用會降低組蛋白乙醯化作用之OP-Cu2+，探討OP-Cu2+對斑馬魚胚胎發育有何影響以及建立篩選組蛋白抑制劑的藥物平台。 材料與方法 藥品：1, 10-二氮雜菲（1, 10-Phenanthroline monohydrat