杀虫安对小鼠脑内氨基酸含量影响.doc

杀虫安对小鼠脑内氨基酸含量影响摘要：目的：研究杀虫安对小鼠脑内氨基酸含量的影响。方法：IcR小鼠30X，随机分为空白对照组、杀虫安低剂量组(200mgkg-1)和杀虫安高剂量组(300 mgkg-1)，小鼠灌胃后出现惊厥时断头取脑，采用液相色谱质谱法测定脑内氨基酸的含量。结果：与对照组相比，杀虫安低剂量组和高剂量组脑内氨基酸含量具有显著性差异。脑内天门冬氨酸和谷氨酸含量升高(P0.05)，而γ氨基丁酸和甘氨酸含量降低(P0.05)。结论：杀虫安引起惊厥时伴有脑内氨基酸含量的变化。 关键词：杀虫安；兴奋性氨基酸；抑制性氨基酸；液相色谱质谱法 中图分类号：R996.3　文献标识码：A　文章编号：1674－0432(2011)－05－0092－2 杀虫安(Profurite aminium)化学名称为2(N，N－二甲胺基)－1，3双硫代酸铵基丙烷，是一种广谱长效高活性的沙蚕毒素新型农药，主要用于防治水稻、蔬菜、柑橘、甘蔗等作物的水稻螟虫、稻纵卷叶螟、甘橘潜叶蛾、菜青虫、蚜虫等多种害虫，具有触杀、胃毒及内吸作用。杀虫安急性中毒时，除引起瞳孔缩小、肌肉松驰和呼吸抑制等症状，还经常出现肌束震颤、翘尾、抽搐等中枢兴奋症状。本实验采用杀虫安给小鼠灌胃，观察小鼠脑内氨基酸递质的变化，以期探索杀虫安导致中枢毒性的机制。 1　材料和方法 1.1药品、试剂和仪器 杀虫安，宁波舜宏化工有限公司提供，含量93％；标准品：甘氨酸(Glγ)、天门冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)均购于美国sigma公司；高氯酸(分析纯，上海金鹿化工有限公司；甲醇(色谱纯，天津四友精细化学品有限公司，0611 19101)；乙腈(色谱纯，天津市四友生物医学技术有限公司，061208101)；其他试剂均为分析纯，实验用水均为重蒸水(本实验室自制)。3200－TRAP LcMs／Ms(美国Applied Biosγstems公司)；D－37520高速冷冻离心机(德国Osterode公司)；Jγ92－2D超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技有限公司)。 1.2脑内氨基酸递质的测定 1.2.1动物分组及给药ICR小白鼠30只(20±2)g，雌雄各半，由温州医学院实验动物中心提供。随机分成对照组、杀虫安低剂量组和杀虫安高剂量组，每组10只，灌胃给药。低剂量组给予杀虫安200mgkg-1，高剂量组给予杀虫安300mgkg-1，对照组给予等容量的生理盐水灌胃。给药后待小鼠出现惊厥时处死，断头取脑组织待测。 1.2.2脑组织样品处理方法取小白鼠全脑，滤纸吸干后，称重。以体积比1：2的比例加入50％的甲醇溶液，在超声细胞粉碎机内制备匀浆液，4℃以下，18000r／min，离心15min，取上清液。上清液稀释10倍，取10μL稀释液，加入100μL同位素内标，涡流混匀2min，15000rpm离心5min，50℃水浴条件下氮气流吹干。加60μL盐酸正丁醇，涡流混匀，15000rpm离,b5min，在65℃下柱前衍生15min，50℃水浴条件下氮气流吹干。用100μLZ,腈：水(8：2)混合液复溶，涡流混匀，15000rpm离,5min，将上清液放入自动进样器的样品瓶中，设定5μL进样，用LC－MS／MS检测。 1.2.3色谱条件色谱柱为ZORBAX Eclipse AAA C18(4.6min×150mm，5μm，Agilent，USA)；流动相为水和乙腈，采用梯度洗脱；流速：1.0ml／min；柱温：50℃；进样量：5μL。 1.2.4质谱条件离子源：电喷雾离子源，正离子模式，多反应监测(MRM)扫描方式；电喷雾电压(Is)：3500V；离子源温度(TEM)：570℃；辅助气1压力(Gsl)：55kPa，辅助气2压力(Gs2)：66kPa；气帘气压力(cuR)：20kPa；碰撞气(cAD)：Medium；入口电压(EP)：10V，出口电压(CXP)：2V。 1.2.5标准曲线的制备与样品分析以各氨基酸与相对应同位素内标的峰面积比值(Ai／As)为纵坐标，以所对应各点浓度(c)为横坐标绘制标准曲线。天门冬氨酸的标准曲线回归方程为γ=3.01×10-5x+0.00969(r＝0.9953)，在100 5000mg?mL-1之间呈良好的线性关系；谷氨酸的标准曲线回归方程为γ 3.49×104x+0.0852(r＝0.9948)，在500 50000mgmL-1之间呈良好的线性关系；甘氨酸的标准曲线回归方程为γ=9.96×10-5x+0.0148(r=0.9942)，在100－5000mgmL-1之间呈良好的线性关系；γ－氨基丁酸的标准曲线回归方程为γ＝4.93×10-5x+0.000