桉树组织培养育苗技术探究.doc

桉树组织培养育苗技术探究摘要：文章主要介绍了两种普遍应用的桉树组织培养育苗技术，其整个试验过程及结果。 关键词：伤组织培养；胚状体的诱导和生长；桉树 中图分类号：S792.39 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2010）-11-0047-1 组织培养是指在无菌条件下，分离并在培养基中培养离体植物组织(器官或细胞)的技术。本文简要介绍了桉树组织培养技术通常使用的两种方法：一是取植株嫩芽段或不定芽接种培养形成?伤组织分化成完整植株；二是取无菌种子或无菌发芽后的苗端诱导胚状体生长成完整植株。 1 伤组织培养 1.1 外植体的采集 是否能够成功建立无菌培养物的重要条件包括采集材料的成熟程度和采集季节。理想的外植体材料应该具备嫩芽的多种特性。研究证明，桉树萌芽率较高的季节是3-5月份，这段时期桉树的茎部含有丰富的营养物质和内源激素，害虫侵害率较低，外植体诱导成功率较高。与此相较，7-9月份属于高温高湿季节，各方面的因素都不利于外植体的采集。因此，采集的最佳时间应选在春季进行，其中以芽条开始膨大，芽鳞片还未裂开为最佳时期。另外，在采集的时候还需要重点注意的一个因素是芽条在植株上的部位。其中萌芽条的梢部因为芽组织幼嫩，消毒过程中易受杀伤，导致褐化严重，不易采用；而萌芽条的上部和中下部茎段的芽不易萌动，木质化程度较好，且易褐化。 1.2 外植体消毒 对室外采摘的成熟的材料进行消毒是不可能不对其组织造成损伤的。现今在外植体芽的处理方面已经采取了多种采收前处理措施。将采集来的桉树嫩茎段去叶，先用自来水冲洗干净，然后用0.05-0.1%(w/v)升汞(HgCl2)处理5-15分钟，或用1-l0%NaOCl或Ca (OCl)2处理10-30分钟，最后用无菌蒸馏水冲洗数次，试验证明，用1%ZePhiran的10%酒精处理桉腋芽外植体10分钟，存活率很高。用饱和的Ca(OCl)2溶液浸泡桉树嫩芽75分钟，接着用紫外灯照射4小时，结果感染率很低，50%的外植体生长正常。 1.3 芽的诱导和增殖 将含有腋芽的茎段接种在1/2MS+0.5mg/L BA+lmg/L IBA的培养基上，在26℃下诱导培养，20-30天之后，肉眼可以观察到已经形成的愈伤组织，一般诱导率在95%以上。通常情况下，愈伤组织呈紧密颗粒状，发生在切口处。有时也发生在非切口处，呈瘤状疏松。之后将业已形成的愈伤组织转移到MS+O.5mg/L BA+0.25mg/L IBA的培养基上，以上两种?伤组织都可在此条件下形成芽。但是区别在于，颗粒状愈伤组织形成单生型芽，芽多而密集，能抽茎和展叶；而瘤状愈伤组织多产生丛生型芽，不能抽茎和展叶。 2 胚状体的诱导和生长 （1）将无菌种子或无菌发芽后的苗段接种在B5或H或改良H+0.8-1.0mg/L KIN+2mg/L-4mg/L 2.4-D+4%-5%蔗糖的固体培养基上；之后3-4天将其放在28℃气温环境和12小时光照条件下使其产生愈伤组织，再经二十余天的迅速增殖，可行成红里带白的愈伤组织。之后把上述愈伤组织及时移到H或改良H+0.2-1.0mg/L BA+0.5mg/L NAA+3-5%蔗糖的固体培养基上，在28℃温度和光照条件下培养一到两周，这段时期?伤组织增殖速度减慢，颜色逐渐转变为粉红色，表面光滑，结构紧致细密。再经过三到六周的培养，愈伤组织逐渐转变为紫红色颗粒状，表面愈加光滑，这就是所谓的胚性细胞团，从中可分化出许多胚状体。 （2）将上述胚状细胞团接种在H或改良H+0.2mg/L BA+0.5mg/L NAA+3-5%蔗糖的培养基上，经过十天到一个月的培养，会看到大量绿苗发出，但发根少。因此把它转入H或改良H+0.5mg/L-1.0mg/L IBA+3%蔗糖的固体培养基上，在28℃和光条件下经过6-8天的培养，会看到根系发达的完整苗木长成。 （3）胚性细胞团具有较长期继代培养而不丧失其分化能力的特性，但是愈伤组织继代三次后就会丧失其分化能力。继代用的培养基仍为前述的分化培养基，继代时的胚性细胞团的大小，以0.1-0.2cm3为宜，继代周期15-30天，以20天左右最佳。 3 试管苗的移植 桉树绿芽接种到生根培养基后，通常情况下12天就能够发根，20天左右已大部分生根完毕，当生根率达到80%以上时，可以将瓶苗移到自然光照下再培养6-10天，使其充分木质化。当观察到叶片舒展，颜色浓绿，根茎伸长时即可移植到瓶外。移苗时先将小流量的自来水冲进瓶内，摇动几次，把苗倒出；再用少量自来水小心冲洗掉残留在根部的培养基，并截掉过长的根部，保留约2cm左右，再用0.1%的杀菌剂对小苗进行消毒处理，用IBA生根激素溶液对其根部进行处理后移入育苗基质中。由于