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Skyline 靶向方法优化 本教程将介绍Skyline 靶向蛋白质组环境中可用于优化选择性反应监测（简称SRM ；亦称为“多反 应监测” ，简称MRM）质谱仪实验方法的功能。 当给定蛋白质的一组理想目标肽段没有或未知时，Skyline 能够简单创建可测量范围十分广泛的各 种肽段的方法，以在样品基质中搜寻最适合测量的肽段。然后，将这些首次测试的结果导入 Skyline ，Skyline 可以帮助您优化方法，以改进下一轮的测量。 我们将这称为“靶向方法优化周期” ，该方法经常以下图体现： 通过循环此周期，您可以从比较笼统的假设开始，包括您想监测的100 多个蛋白质，快速缩小清 单至最佳肽段、子离子和仪器设置以便达到您的实验目标。 本教程将引导您逐步完成此优化周期的两个半循环，以便让您知晓如何进行更多的循环来创建充 分优化的定量方法。 入门指南 要开始本教程，请下载下列ZIP 文件： /tutorials/MethodRefine.zip 将文件解压到您的电脑的某个文件夹，比如： C:\ Users\brendanx\Documents 1 这将创建一个新文件夹： C:\ Users\brendanx\Documents\MethodRefine 现在通过双击，或使用一个正在运行的Skyline 的“文件”菜单下的“打开”命令来打开新文件夹中的 WormUnrefined.sky 文件。 结果数据 选择文档中的第一个肽段(YLGAYLLATLGGNASPSAQDVLK) 。Skyline 将同时显示图谱库中的MS/MS 图谱和相应的在MacCoss 实验室仪器上获得的肽段的子离子y3 – y15 的时间-强度色谱图数据： 请注意，与每个肽段相关联的MS/MS 谱图库通常来自于离子阱质谱仪进行的实验。 在左侧的肽视图中，Skyline 在肽段序列的左侧显示绿色、黄色和红色点。它们为峰质量图标，其 含义分别如下：  绿色— Skyline 选择的最佳峰的所有离子对形成一共洗脱峰。  黄色— 至少一半的离子对形成一共洗脱峰。  红色— 不到一半的离子对形成一共洗脱峰。 色谱图数据最初从39 Thermo 原始文件导入该文档。若要了解为何此文档中对这些肽段的一次测 量需要39 次单独进样，首先请注意Skyline 窗口右下角的数字。您可以看到该文档包含225 个肽 段和2096 个离子对，涵盖各肽段的y3 – y(n-1)子离子 （其中n 是整个肽段序列中氨基酸的个数）。 2 您正在查看的Skyline 文档旨在帮助您确定在特定目标基质中哪些肽段是可以测量的，以及哪些是 可测肽段的最佳离子对。每个肽段都拥有大量的离子对可以使我们获得对给定的峰确实是在测量 目标肽段的置信度。这种置信度是通过计算所研究的肽段的离子对峰强度和相同肽段的谱图库1, 2 之间的点积值相关性来测定的。 未优化的方法 若要了解本文档中测量肽段所需的离子对列表生成方法，请按照如下步骤操作：  在“文件”菜单上，选择“导出” ，并单击“离子对列表” 。  选择“多个方法” 。  在“每次进样允许的最多离子对数” 中输入“59”。 “导出离子对列表”表单应如下所示：  单击“确定”按钮。  找到下一表单中的MethodRefine 文件夹。  在“文件名” 中输入“worm”。  单击“保存”按钮。 3 如果您使用Windows Explorer 查看MethodRefine 文件夹的内容，您将看到现在它包含了39 个新 的CSV 文件(worm_0001.csv – worm_0039.csv) 。每个文件大小约为4K ，且包含一个最多不超过59 个离子对的列表，用于导入到一个未安排时序的Thermo TSQ 方法。 选择59 这个数字可能显得有点奇怪，但是这对于获得与原始实验匹配的离子对列表很有必要。原 始实验选择的数字为60 。遗憾的是，Skyline 曾经存在一个只能允许少于最大值的离子对数量的漏 洞（现已修复）。 导入多个进样数据 如果您想要学习如何导入这个实验的初始仪器输出文件的方法，您必须下载另一个ZIP 格式的补 充文件(36M)。该ZIP 文件包含MacCoss 实验室收集的39 个Thermo 原始文件（161