ni-nta 亲和层析介质 - 金斯瑞.pdf

  Ni‐NTA 亲和层析介质  1、产品描述      金斯瑞Ni‐NTA 亲和层析介质（产品编号L00250）是把NTA （氮川三乙酸）共价偶联到4%交联的琼脂糖介质 上，再通过NTA 的4 个结合位点螯合Ni2+制备而成的亲和层析介质。Ni‐NTA 亲和层析介质的Ni2+脱落率非常低， 它能耐受蛋白纯化过程中使用的很多添加剂，并且有着较高的蛋白结合能力和稳定性，因此 Ni‐NTA 亲和层析介 质非常适用于多组氨酸重组蛋白的纯化。我们提供10 ml，25ml，500 ml 三种规格的包装。    表1：产品特征  柱体积                 10 ml、25 ml 和500 ml （20 ml、50 ml 和1000 ml 的50 %悬浆液）  吸附量                每毫升填料吸附量20 mg 6xHis‐tagged  蛋白（27 kDa）  基质                  4%交联琼脂糖  平均粒径              90 μm （45‐165 μm）  保护液                 1×PBS （含 20%乙醇）  存储条件              2‐8℃  保质期                2‐8℃储存18 个月    表2：Ni‐NTA 亲和层析介质可耐受试剂  变性剂            表面活性剂           还原剂              盐              其他   6 M 盐酸胍        2%Triton X‐100         20 mM β‐ME        4 M MgCl           50%甘油  2 8 M 尿素          2% Tween 20            1 mM DTT          5 mM CaCl2              20%乙醇                    1% CHAPS                                 2 M NaCl           1 mM EDTA      2、纯化步骤    2.1 常规条件下纯化多组氨酸标签蛋白    2.1.1 试剂准备  所用缓冲液需采用高纯水配制，使用前建议用0.45 μm 滤膜过滤。  Lysis 平衡缓冲液（LE Buffer）：50 mM Na HPO , 0.3 M NaCl, pH=8.0  2 4 洗涤缓冲液：50 mM Na HPO , 0.3 M NaCl, 10 mM imidazole pH =8.0  2 4 洗脱缓冲液：50 mM Na HPO , 0.3 M NaCl, 250 mM imidazole pH =8.0  2 4   2.1.2 样品准备  大肠杆菌中表达的重组蛋白  1）4 ℃离心（如：5000 rpm 离心5 分钟）收集50 ml 培养基中的细胞。  2 ）加入8 ml LE Buffer 重新悬浮细胞，如有需要可加入适量的PMSF 或者其他蛋白抑制剂。        注意：加入的蛋白抑制剂应确定它不会和Ni‐NTA 亲和层析介质反应。  3 ）超声破碎细胞，在冰上进行操作，破碎  1 秒，冷却 3 秒，总时间为 30‐45 分钟；         可选：如果样品太粘稠，可加入RNase A