色谱常见问题问与答（二）.doc

色谱常见问题问与答（二） ……你有没有在实验过程中遇到过上述色谱问题？快来看看《色谱常见问题问与答》吧！ 问：柱子在什么情况下可以清洗一下筛板呢？原来也讨论过这个问题，我也拆下来清洗过，但我看到柱前段的污染更甚，于是就用刀片刮了刮，然后把清洗好的筛板安装上去。问题解决了，但使用寿命会不会减少呢？ 答：柱头污染了，就取出污染的那部分，再装一些填料。因为假如你刮了些填料，那么微观的塔板数就少了。假如你刮得不多，仅表面，可能就是一些脏物，所以，问题解决。但是今后还会有同样问题，再刮，如果不小心刮，就会影响柱效。建议还是装一个预柱。 问：如果柱子取下来放置一段时间，需要做什么保护吗？ 答：对一般的反相柱，也就是洗干净后放到纯甲醇(乙腈)或者是80%左右的甲醇(乙腈)水中，然后用堵头塞紧柱两头，以免保存溶剂挥发，不需要做特殊的保护。 问：预柱或保护柱用还是不用的问题。原来分析中药品种时，我一直都是用保护柱。但来到新公司后，发现大家都没有使用，几个实验室连保护柱都没找到一个，也就是说大家从来都没有用过。后来问一个老员工，说是有可能影响药品分析。我就想问：安装保护柱后会影响样品分析吗？我们做的大多是头孢类的抗生素。 答：应该这样说，加上保护柱，肯定有利于保护色谱柱不受一些细小颗粒物质的堵塞，但同时也对分离度和柱效有影响，因为保护柱中间有着死体积的存在。但是如果保护柱接得好，并且尽量控制其匹配性和经常更换，分离度和柱效应该影响并不大。头孢类的抗生素也要看到底是原料药还是制剂，有些原料药，可以根据色谱柱的损耗选择添加预柱(中间是个筛板)，制剂的话，如果有辅料严重干扰或者流动相盐分比较大，那还是最好配个保护柱。 问：用的是四元梯度泵A50%甲醇B50%水，经常出现停或进气泡这是什么原因？ 答：水/甲醇比例在55/45时，黏度和柱压有个极大值。50/50接近了这个极值，柱压是比较高的，但影响柱压最大的还是填料粒径和色谱柱内径，你这个实例中不知用的什么规格的色谱柱？系统压力高，可能会因溶剂泵中的过滤头供液速度跟不上而导致气泡进入系统，停机也应该是因为气泡进入压力下降的原因，可考虑更换液体通量更大的过滤头。问：我在做多肽药物时遇到下列问题：1) 基线不稳定波动大，流动相A:1%TFA水溶液，B:1%TFA乙腈溶液，检测波长210nm 流速1.0ml/ml，什么原因？怎么解决？TFA有什么作用？流动相中不加TFA见不到主峰，基线良好。2) 做完肽类样品时怎么冲洗C18比较好？3) 药典上介绍测定分子量大于2000的样品，选择柱子填料的孔径为300?，300?与100?对结果有什么区别？ 答： 1) TFA应该是起“离子对”的作用。在反相色谱分离多肽和蛋白质的实验中，使用TFA作为离子对试剂是常见的手段。流动相中的TFA通过与疏水键合相和残留的极性表面以多种模式相互作用，来改善峰形、克服峰展宽和拖尾问题。TFA优于其他离子修饰剂的原因是它容易挥发，可以方便地从制备样品中除去。另一方面，TFA的紫外最大吸收峰低于200nm，对多肽在低波长处的检测干扰很小。 2) 因为做多肽样品要用到TFA添加剂，所以实验完成后，先用不含TFA的流动相冲柱，然后再将流动相置换成色谱柱的保存流动相，存柱。 3) 在做多肽类样品的时候，300?孔径的填料相对100?孔径，孔径大的话，多肽分子不容易堵孔。 问：反相离子对色谱法中，离子对是如何起作用的，是离子对试剂的非极性端溶解在填料的非极性端里，解离端伸向流动相，对含胺化合起离子交换作用，还是样品与离子对生成紧密的结合物，离子对试剂掩藏化合物中的极性基团，还是这种结合物是在解离与结合的动态平衡之中？ 答：首先离子对试剂的解离端和目标离子形成离子缔合物，降低其极性，这样就能较好的在柱子上保留。再者，根据疏水效应理论，离子对试剂的疏水端是很容易和C18链相互作用的，这样更容易在柱子上保留，所以我认为离子对试剂作用是混合保留机制，即纯粹的反相保留和离子对保留机制共同作用。