亚细胞结构线粒体提取试剂盒.pdf

亚细胞结构线粒体提取试剂盒 产品编号： AR0156 产品批号： 见外包装标签 产品保存： -20ºC保存，一年有效，台盼蓝可4ºC保存。 产品说明：细胞线粒体提取试剂盒用于从动物细胞或新鲜组织中分离出完整的线粒体，然后 用含有蛋白酶抑制剂的裂解液裂解线粒体得到纯度高的线粒体蛋白。适合于新鲜 的动物组织以及培养细胞的线粒体蛋白的制备。线粒体的分离基本原理是，加入 缓冲液匀浆通过机械方法破碎组织或培养细胞，经过低速差速离心去除残渣碎屑 和巨大细胞器，然后通过高速差速离心获得线粒体。获得的线粒体具有完整的膜 结构及生理功能。获得的线粒体也可以被试剂盒中的线粒体裂解液或其它适当裂 解液裂解后用于SDS、IP、免疫印迹、双向电泳、免疫共沉淀，酶活测定等 后续蛋白分析等。 产品规格： 成分 规格 线粒体抽提液 100ml 线粒体裂解液 50ml 台盼蓝染色液 10ml PMSF （100mM） 1ml 使用方法： （一） 线粒体的提取 溶液准备：室温溶解各溶液，置于冰上，根据需要取适量的抽提液和裂解液，临用 前按比例加入 PMSF，使 PMSF 的终浓度为 1mM。 1. 样本处理 a. 组织处理：称取 100-200 mg 新鲜组织，预冷的 PBS 或生理盐水冲洗，洗净血水， 滤纸吸干，用剪刀剪为碎块放入小容量玻璃匀浆器内。加入 10 倍体积的预冷的线 粒体抽提液，在冰上匀浆 （匀浆程度判定：肉眼观察没有明显的组织碎块）。 b. 细胞处理： （对于悬浮细胞，直接离心收集细胞。对于贴壁细胞，用细胞刮刮下 细胞，离心收集细胞。）用预冷的 PBS 或生理盐水重悬细胞，剩余细胞 600g，4℃ 离心 5分钟沉淀细胞,尽量吸尽上清，加入适量的预冷的线粒体抽提液(约为细胞 湿体积的的 5-7倍)，用移液器吹打数下，使抽提液和细胞充分接触，冰上孵育 10-15 分钟，期间拿出震荡数次 （此时可以取少量细胞液用台盼蓝染色，细胞液 和台盼蓝按 1：1的比例混合，镜检，当有 80%的细胞为蓝色时，可不必匀浆， 若不够，把细胞悬液转移到一适当大小的玻璃匀浆器中匀浆几下，镜检，直到达 到 80%）。 注意：请勿过度匀浆，过度匀浆会导致线粒体的机械损伤。 2. 将匀浆液转移到离心管，4℃，600g 离心 10分钟。细胞核、大的膜碎片、未裂解细 胞等沉淀在管底。（如需获得纯度更高的线粒体，可以将此步骤的离心速度改为 1000g， 其它离心条件不变；获得更高纯度线粒体的缺点是相同数量细胞的线粒体抽提得率会 下降。） 3. 将上清液转移到新的离心管，4℃，12000g 离心 10 分钟，离心后的上清含胞浆成分， 小心去除上清，沉淀即为分离得到的线粒体。 （如需获得纯度更高的线粒体，可以将 此步骤的离心速度改为 16000g，其它离心条件不变；获得更高纯度线粒体的缺点是 相同数量细胞的线粒体抽提得率会下降。） （二） 蛋白的提取 1. 按每 10ul 线粒体压积中，加入 50-70ul 上述配制好的线粒体裂解液。 2. 置于 4℃15-30 分钟，期间拿出震荡数次。 3. 10000g，4℃离心 10 分钟，取上清为线粒体全蛋白提取物。 注意事项： 1.整个操作过程为保证线粒体的完整，应尽量是操作的环境如温度 （0—4℃）和 PH(7.0 左 右）保持恒定，同时尽可能短操作时间。 2. 匀浆次数依照匀浆器的松紧而定，次数过少，细胞破损不完全，就会影响线粒体产量。 3