活体成像技术试验设计与应用介绍.ppt

* 如图所示使用白光作为背景只能将药物信号定位在小鼠的大腿部位，而X光成像则可以显示清晰的骨骼结构将信号定位于关节位置. * 如图，用荧光素酶标记肿瘤细胞，用荧光染料标记肿瘤药物，用X光成像作为解剖学背景，三者相叠加，既能准确定位肿瘤细胞在体内的位置，又能看到肿瘤治疗的药物在体内的分布，是否靶向到肿瘤，直观明了，很有说服力。 使用荷有4T1luc肿瘤细胞的小鼠模型；肿瘤细胞稳定表达生物素酶，通过生物发光技术显示肿瘤位置；用CY5.5近红外荧光染料标记VEGF(血管内皮生长因子)的单链抗体，静脉注射后，采用荧光成像技术显示抗体体内分布和代谢信息。 小鼠前腿接种MDA-MB468乳腺癌，Cy7标记的CCPM纳米颗粒注射小鼠后不同时间点荧光成像。 CCPM是一种微球其内部包裹荧光染料，可以用作肿瘤细胞的特异性标示；DTPA是金属同位素螯合剂，用于同位素标记。采用乳腺瘤裸鼠模型，通过尾静脉注射111In标记的DTPA-CCPM分子，利用放射性同位素成像和近红外荧光成像技术，在不同时间点进行活体成像，观察染料分子在体内的分布与代谢情况。结果显示，这种染料分子可以特异性靶向到肿瘤细胞，并表现出良好的半衰期，展现了很好的药用前景，为肿瘤治疗研究提供新工具。 利用近红外染料和放射性核素标记的环状RGD肽进行整合素受体阳性表达的肿瘤生物发光、荧光、Gamma闪烁成像和SPECT多模式成像。 2×105个4T1luc细胞皮下接种到小鼠的肩部。肿瘤最大直径长至5–10mm进活体成像研究，静脉注射111In-LS-308（环肽RGDyK的类似物）不同的时间点进行活体成像。 注：LS308：cypate-labeled cyclic RGD peptide，可特异性结合到肿瘤细胞表达的αvβ3整合蛋白;111In（放射性同位素铟）标记LS308 ；表达 luc的乳腺癌肿瘤模型；生物发光：hot; behind；NIR：rainbow;upfront；L：肝；K：肾脏；红色圆圈：肿瘤位置；视野：80mm,光圈：2.8，bining:2×2bining；激发：755，发射：830；IS4000MM * * * * * * * * * * * 使用裸鼠动物模型，皮下接种稳转GFP和RFP的肿瘤细胞。所用纳米材料，共标记三种分子，一是CY5.5近红外荧光染料，二是抑制GFP表达的siRNA，三是协助靶向的一种跨膜多肽MPAP。静脉注射后48小时成像，结果显示，纳米材料已富集到肿瘤部位，GFP表达水平显著下降，但RFP表达未受影响。此实验揭示一种纳米材料可以承担多重生物反应作用，不仅可以进行活体成像，还可以携带药物进行肿瘤治疗。 * * * 报告基因的选择 成像模式 基因 激发与发射波长(nm) 说明 生物发光 Fluc 560 需要注射底物 Rluc 475 需要注射底物 荧光 mKate2 588/633 近红外波段 TagRFP 555/584 红/橙 TagYFP 508/524 黄 TagGFP2 483/506 绿 注：荧光蛋白的信息来源于 注射麻醉： 腹腔注射：如戊巴比妥钠（1%，7 μ L/g） 气体麻醉： 小动物麻醉机：如异氟烷（2-5%） 动物麻醉方式的选择 注意事项： 小动物麻醉程度适度：麻醉过深加大死亡概率、剂量不足会出现抽搐 反复麻醉易导致死亡；注意麻醉动物的保温 小动物存在种属和个体差异，不同动物模型使用剂量不同 戊巴比妥等麻醉剂溶液长时间放置容易失去药效。 脱毛方式： 剃刀、电动剃毛器 化学脱毛剂 脱毛剂： 人用脱毛剂-带自发荧光 自配脱毛剂：8% NaS + 30% 无水乙醇 注意事项： 适量涂抹；清洗；适量配备；低温、 避光、密闭保存； 脱毛原因：荧光拍摄时毛发产生背景噪音 并影响光的穿透 脱毛方法的选择 L O G O 底物注射方式：一般通过腹腔注射打入底物(150μg/g)，偶尔也可原位注射; 生物发光时间：注射底物约一分钟后表达荧光素酶的细胞开始发光；十五分钟后强度达到最高； 发光持续时间：最高点持续约20～30分钟后开始衰落，约三小时后发光全部消失； 最佳检测时间：注射后12到25分钟之间; 麻醉时间：发光底物注射后7-8min开始麻醉; 生物发光成像时间点的选择 L O G O 文献检索染料的激发发射波长和特点 体外用多光谱拍摄模式寻找最佳激发发射波长和最适浓度。使用黑色底透板拍摄（costar，货号3603），EP管对结果有一定影响 体外数据作为参考，在体拍摄预实验也要用多广谱拍摄再优化一下拍摄参数（光的穿透和背景噪音等的影响） 荧光成像实验的注意事项 预实验的重要性 一、预实验前的工作： 动物模型的建立：荷瘤模型、疾病模型… … 仪器