猪体细胞克隆及相关生物技术的分析.pdfVIP

摘要 本文系统研究了猪体细胞核移植技术的相关环节，并对其中的某些条件进行了优化。初 步建立了相关的技术体系，为后期实验的开展奠定了坚实的基础。 本实验建立了小香猪耳上皮细胞、胎儿成纤维细胞和荣昌猪耳上皮细胞、颗粒细胞三种 体细胞细胞系。在实验中初步探索了在体外条件下对上述三种细胞进行原代培养、传代培养、 细胞纯化、细胞周期同期化处理及冷冻保存的方法。结果表明三种细胞的培养效果均与接种 密度有关。颗粒细胞对此尤为敏感，当接种密度低于5×104／ml时，很难达到汇合期并继续 传代。耳上皮的分生能力最强。胎儿成纤维细胞则介于援者之间。冷冻对细胞有损伤，解冻 后有近50％的细胞死亡且第一次传代时细胞的生活力明显下降，袭现为生长速度降低，但在 后续的传代过程中可以恢复。 我们还通过脂质体介导法获得了转绿色荧光蛋白(GFP．fleo“)基因的胎儿成纤维细胞系， 并初步比较了不同浓度G418及筛选方法对细胞纯化效果的影响。结果表明在一定范围内阳 G418可获得较好的筛选 性率随基因量的增加而增加。传代培养时向培养液中添加30099／ml 效果。 类对核移植胚胎的融合与发育也有重要影响．以胎儿成纤维细胞为核供体的核移植胚和以颗 胎儿成纤维细胞与另两种细胞的对应项之间差异不显著(p0．05)。 在高cd+融合条件下，融合胚胎再进行电激活处理会导致猪颗粒细胞核移植胚骀发育潜 力下降，卵裂率、囊胚率和平均囊胚细胞数分别为50．5％、19．2％和24．7。但与不激活组 (62．O％，19．3％和27．8)无统计学差异(p0．05)。 在孤雌激活实验中还发现激活液中不同cd+浓度对猪体外成熟卵母细胞孤雌激活效果 有显著影响。虽然低Ca”浓度激活的卵母细胞卵裂率稍高，但高Ca2+激活的囊胚率和囊胚 细胞数均有显著的提高(8．5％vsl6．1％和22．4vs30．4，p0．05)。 关键词：猪，体细胞核移植，ca2+浓度。电融合，电激活，转基因 Abstract transferstudied inthis cellnuclear was of somatic systematically The Dorcine technique this astoincreasethe of have severalrelatedfactorsso technique We optimized efficiency papeL the research． and a basisfor future set stable up fromtheearskin celllinewere isolated fetaifibroblast Bothof and successfully epidermal ofalocalbreed attheof3menandthefetusof30d．Bothof and pig age epidermal mine