棉铃虫幼虫中肠类胰蛋白酶基因的克隆及在大肠杆.PDFVIP

动物学报 　48 (6) :790～796 , 2002 A cta Zoologica S inica 　　　　　 　 棉铃虫幼虫中肠类胰蛋白酶基因的克隆及 在大肠杆菌中的表达 常团结　陈　蕾　路子显　陈宛新　孟　昆　朱　祯 ( 中国科学院遗传与发育生物学研究所, 北京 100101) 摘　要 　根据昆虫类胰蛋白酶序列的保守性设计了一对引物 , 以棉铃虫 ( Helicoverpa armigera ) 幼虫中肠总 RNA 反转录出 cDNA 第一链作为模板 , 利用 RTPCR , 分离出了一种棉铃虫类胰蛋白酶 ( Ha T) 基因的 cDNA 序 列。分析表明该 cDNA 序列的开放阅读框为 696 bp , 编码一个由 231 个氨基酸残基组成的多肽 , 推测的氨基酸序 列具有 His57 、Asp 102 、Ser192组成的电荷中继网 , 决定胰蛋白酶底物专一性的 Asp 189 , 底物结合部位的 Gly216 和 Gly226 残基 , 及其它胰蛋白酶结构上的保守区域。氨基酸序列同源性比较表明 : Ha T 同其它鳞翅目昆虫类胰蛋白 酶有较高的同源性 , 同源性在44 %～79 %之间。为研究棉铃虫类胰蛋白酶基因 ( hat) 编码产物的活性 , 将其插 入原核表达载体 p GEX4 T3 和p ET23b 中 , 并在大肠杆菌中进行了诱导表达 , 结果表明 , GSTHa T 融合蛋白在 大肠杆菌中进行了特异表达 , 非融合形式的表达产物 Ha T 具有胰蛋白酶催化活性。 关键词 　棉铃虫 　幼虫 　类胰蛋白酶 　同源性 　基因表达 　酶活性 　　棉铃虫是许多作物 , 如棉花、玉米、小麦的重 不仅可以丰富有关蛋白酶生理作用的了解 , 而且可 要害虫 , 广泛分布于非洲、亚洲、印度、澳大利 以为虫害防治提供理论上的依据。本文报道一种棉 亚、太平洋和欧洲等 地 区 ( Johnston et al . , 铃虫幼虫中肠类胰蛋白酶基因的克隆及其在大肠杆 1991) 。转基因植物的出现为抗虫工作开辟了一条 菌中的表达。 新的途径。Hilder et al . ( 1987) 获得了具有抗虫 1 　材料和方法 性的转蛋白酶抑制剂基因的烟草。由于蛋白酶抑制 剂仅能抑制某些类型的蛋白酶 , 因而为了更好地利 11 　材料 用蛋白酶抑制剂防治害虫 , 有必要了解害虫中肠的 棉铃虫由中国农业科学院植物保护研究所棉虫 蛋白酶。研究表明 , 鳞翅目昆虫如棉铃虫等主要利 组提 供 , 饲 养 至 四 龄。质 粒 pBlue KS ( + ) 、 ( α 用丝氨酸蛋白酶初步消化食物中的蛋白质 John p ET23b 、p GEX4 T3 、及菌株 E . coli DH5 和 E . ston et al . , 1991 ; Christeller et al . , 1992) 。昆虫 coli BL21 (DE3 ) 为本实验室保存。牛胰蛋白酶 丝氨酸蛋白酶基因是一个大家族 , 包括许多不同的 ( Trypsin) 和底物 BAEE 购自 Sigma 公司。限制性 成员 , 国外已从鳞翅目、双翅目、鞘翅目等昆虫分 内切酶、Klenow 大片段、T4 DNA 聚合酶和 T4