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高瞻生物教材手冊 第一單元：蛋白質電泳 一、電泳原理 帶電分子在電場中會隨電流 而移動， 此現象稱之為 「泳動 」，泳動的 大小程度稱之 為 「泳動率 」(mobility) 。泳動率與分子的電荷密度成正比，而與分子受到的摩擦力成反 比，摩擦力與分子的 大小和形狀有密切相關，分子量大的分子， 摩擦力大 、泳動率小 ， 分子量小的分子，摩擦力小、泳動率大；至於分子形狀的部份，通常球形分子摩擦力較 小，泳動率大。 蛋白質分子上的淨電荷，取決於環境的 pH 値，若環境 pH 高於 此蛋白質分子的 pI 値 ，此蛋白質帶淨負電，反之帶淨正電；若剛好等於其 pI 値 ，淨電荷則 為零 ，因此同 一分子在不同酸鹼 環境下，可能帶不同的 淨電荷 。在電泳系統中，帶負電的蛋白質 分子 會往正極泳動 ，帶正電的蛋白質 分子則往負極泳動 ，不帶電者則不易泳動。由於 大部分 電泳系統的 pH 値 定在 8.3 左右 ，在此pH 値下，凡是 pI 値 小於 8.3的蛋白質 分子 均帶負電荷，可以往正極跑。 二、聚丙烯醯胺膠體電泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis ，簡稱PAGE ） 聚丙烯醯胺膠體電泳是最普遍的蛋白質電泳，其種類分為以下三項，分述如下： 1. 原態膠体電泳（Disc）：PAGE 系列的最基本型式，蛋白質以原態進行電泳， 因此酵素活性在電泳後得以保持，可在膠片上直接做活性測定或染色；若能收集到 膠体上的蛋白質，則亦可用來製備酵素。因為樣本蛋白質保持在原態下，所帶的電 荷、分子大小、分子形狀等，對其泳動率均有影響。 2. SDS膠体電泳（ SDS）：SDS 是界面活性劑，可使蛋白質變性，並在分子表 面均勻佈上一層負電荷，因此在 SDS系統中，樣本分子的泳動率僅取決於其 分子量，而與原來分子所帶的電荷無關，故 SDS可用來測定變性狀態 (denatured) 蛋白質之 分子量。 3. 梯度電泳：梯度電泳使用由稀到濃的梯度膠体，膠体中的孔徑由上到下逐漸變小， 樣本中分子量越小的分子，就可跑得越下面，因此它可說是依分子量大小來分離的。 但需注意許多 pI 大於 8.3的蛋白質，在電泳 pH 條件下所帶的淨電荷為正電，在 膠体中根本不會往下跑。梯度電泳也可加入 SDS ，成為梯度-SDS，其解析度 將會大大的增強，是最理想的電泳型式。 三、SDS（SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis ） SDS （Sodium dodecyl sulfate ，十二烷基硫酸鈉，NaC H SO ）是洗碗精的主要成 12 25 4 分，在 SDS電泳系統中，利用界面活性劑 SDS附在蛋白質疏水區表面，由 SDS 本身所帶之負電荷引導泳動。由於蛋白本身所帶電荷遠小於附著之 SDS 分子，因此蛋 白質本身的電荷對泳動率沒有影響，泳動率只決定於蛋白質分子量，故 SDS電泳適合 測定蛋白質的分子量。在樣本處理過程中，利用加熱破壞蛋白質的三級及四級結構，使 其分子內部的疏水區暴露而與 SDS 結合 ，因此 SDS廣泛地應用於蛋白質次單 元體分子量的決定。 四、SDS膠體構造 1. 單體分子 (monomer) ：丙烯醯胺(acrylamide) ，H C=CH-CO-NH 2 2 2. 架橋分子(bridge) ：Bis 【N,N-methylene-bis(acrylamide) 】，可看作兩個丙烯醯 胺單体分子連結在一起，可形成分叉點，以構成立体結構。 ※Acrylamide 及 Bis都有神經毒性，要帶手套，並避免吸入塵埃。 3. 游基 (free radical) 產生者：通常使用過硫酸銨 (ammonium persulfate, APS)或 者 riboflavin (即維生素 B ) 。 2 4. 催化劑：TEMED (tetramethy