项目名称：藕合型毒素cry-a的设计及其对bt抗性害虫杀虫机理的研究 .doc

项目名称：藕合型毒素cry-A的设计及其对Bt抗性害虫杀虫机理的研究 英文名称：Bioconjugation of cry-A and its insecticidal mechanism against Bt resistant insects 摘要：藕合型生物杀虫毒素cry-A，是基于生物藕合技术和生物合理设计途径，将胃毒作用的cry毒素蛋白分子与神经毒素阿维菌素分子连接形成的单体双毒素，以克服农业害虫对Bt毒素的抗药性。本项目利用基因工程获得各种基因型的cry毒素蛋白，构建cry-A的藕合平台，并通过SDS、高效液相色谱，荧光光谱法和Octet RED System验证产物，以保证实验的可靠性。研究cry-A对Bt抗性害虫的杀虫毒力，并综合利用荧光定位，Octet RED System和RT-PCR等手段探索cry-A克服农业害虫对Bt毒素抗性的分子机制。本项目首次从生物藕合角度出发，研究农业害虫的抗药性，为新型农药的开发提供新的方向。 英文摘要：Cry-A is a biological insecticide toxin, which is formed by bioconjugating stomach toxin Bt cry toxin with neurotoxin Avermectin (AVM). In this studyt, we study the insecticidal toxicity of cry-A against Bt resistant insects and investigate its insecticidal mechanism against Bt resistant insects. SDS, HPLC, fluorescent spectrometry and Octet RED System are used to confirm cry-A to make subsequent study scientifically. We study the insecticidal mechanism against Bt resistant insects by fluorescence positioning，immunohistochemical stain, Octet RED System and RT-PCR. This is the first study about Bt resistance of agricultural insects by bioconjugation, it will be a novel direction for the development of new pesticides. （一）立项依据与研究内容（4000-8000字）： 1. 项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参考文献目录） 1.1研究意义 苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）是目前世界时应用最广泛的微生物杀虫剂，它能产生多种生物活性物质，其中最主要的杀虫成分是杀虫晶体蛋白（insecticidal crystal proteins, ICPs）,又称δ-内毒素，对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目、同翅目等昆虫，以及动植物线虫、蜱螨等节肢动物都有特异性的毒杀活性，专一性强、效果好、无污染，而对非目标生物安全，因此一直是农业害虫生物防治的研究热点[1-2]。Hofte和Whiteley根据Bt毒素蛋白的氨基酸序列和杀虫谱的不同，将已发表的4种Bt蛋白分为5群14亚类，其中只有杀虫活性的13亚类命名为狭义的晶体蛋白基因，即cry基因[3]。cry1Aa，cry1Ab，cry1Ac，cry2Aa，cry3Aa 5个基因是目前研究最为广泛、杀虫毒力最高的基因种类之一，其作用对象包括了对鳞翅目，对鞘翅目和对双翅目害虫[4-5]。 随着Bt杀虫剂的大面积的使用及其转Bt植物的大范围的推广，农业害虫对Bt毒素的抗性亦逐年增加。因此，如何有效的克服农业害虫对Bt毒素的抗药性，成为Bt杀虫剂研究领域的新热点。目前，农业害虫对Bt毒素的抗性机理尚不明确，而Bt毒素的杀虫机理较为经典的观点为：Bt毒素被敏感农业害虫取食后，在中肠激活，形成活性毒素。随后与中肠上皮细胞刷状缘膜（BBMV）上的受体结合，继而部分或全部插入膜内，形成孔洞或离子通道，最终导致细胞渗透裂解[6]。在此过程中，毒素与受体的相互作用是影响毒力的关键。氨肽酶N（APN）是第一个被发现在Bt毒素机制中有作用的毒素受体蛋白。Knight等人和Gill等人通过cD