蛋白质荧光标记中协同效应的高效液相色谱 - 生物分子高效分离与表征 .pdfVIP

维普资讯 V0l_28 高等 学校 化 学 学报 No．9 2007年9月 CHEMICALJ0URNALOFCHINESEUNIVERSⅢ ES 1657～1659 [研究快报] 蛋 白质荧光标记中协同效应的高效液相色谱 乔晓强，张 琳，梁 振 ，张维冰，张丽华，张玉奎 (中国科学院大连化学物理研究所，国家色谱研究分析中心，大连 116023) 关键词 荧光标记；蛋白质；协同效应；高效液相色谱 中图分类号 0657 文献标识码 A 文章编号 0251-0790(2007)09—1657-03 荧光检测因具有高灵敏度、高选择性等特点在生命科学及环境科学等许多领域中得到了广泛应 用 J．5．{[((2．碘代乙酰)胺)乙基]氨基}萘．1磺酸(1，5．I．AEDANS)作为一种水溶性好且容易与半胱 氨酸反应的荧光试剂 J，在蛋白质的荧光标记方面具有广阔的应用前景．Gorman等 利用聚丙烯酰 胺凝胶 电泳检测到了25ng1、5．I．AEDANS标记的牛血清白蛋 白．Clements等 将 1，5-I．AEDANS标记 的牛血清白蛋白和Ot．乳 白蛋 白的酶解产物利用固定化金属亲和色谱进行选择性富集 ，实现了半胱氨酸 肽的定量分析． 协同效应是一种普遍存在的自然现象 J．一般认为与非线性过程有关，或为多种因素综合作用 的结果．本文以牛血清 白蛋白和胰岛素为研究对象，经 1，5．I．AEDANS衍生后，采用高效液相色谱 (HPLC)进行分离分析，发现两者的衍生存在明显的协同作用． 1 实验部分 1．1 仪器与试剂 Jasc0PU．1580高压液相泵 (Jasco，日本)；JascoLG．1580-04自动梯度控制仪(Jasco， 日本)；JascoFP．1520荧光检测器 (Jasco，日本)；7725六通进样阀(Rheodyne公司，美国)；色谱柱 (C，5 m，30nm，250mmx4．6mm)；Echrom98数据采集器(大连依利特分析仪器有限公司)． 乙腈(色谱纯，德国Merck公司)；碳酸氢铵(NHHCO ，辽宁省医药工贸公司试剂厂)；牛血清 白 蛋白(BSA，上海长阳制药厂)；胰岛素(Insulin，美国Sigma公司)；三氟乙酸(TFA，美国Sigma公司)； 1，5-I-AEDANS(美国Sigma公司)；尿素(Urea，沈阳市试剂三厂)；三(羟 甲基)氨基 甲烷 (Tris，美 国 Sigma公司)；氯化钠 (NaC1，沈阳市试剂三厂)；乙二胺四乙酸二钠(EDTA，Biobasic公司)． 1．2 衍生化过程 在文献[4]报道的方法基础上，对衍生化条件加以改进，衍生时间增加到 1h，衍生 温度提高到5O℃，衍生试剂质量浓度提高到 18mg／mL． 具体衍生过程如下：取6O 的牛血清 白蛋 白和胰岛素混合液 (50mmol／LNHHCO，pH8．0)， 加入25 L的变性缓冲溶液(8mol／LUrea，200mmol／LTris，pH8．5，200mmol／LNaCI，0．5mmol／L EDTA)和 15txL100mmol／LDTF．在56℃下搅拌反应30min后，加入2O 18mg／mL1，5．I-AE- DANS．继续在 5O℃下搅拌反应 1h，使衍生化反应完全．冷却至室温后进行HPLC分析． 1．3 HPLC分离条件 流动相A：水，含体积分数为0．1％的TFA；流动相B：乙腈／水(体积比95／5)， 含体积分数为0．1％的TFA；梯度条件：0min，体积分数为20％的B；40min，体积分数为 100％的B， 流速 1mL／min，进样 1OtxL；柱温：室温；荧光激发和发射波长A ／A =336／490nm． 2 结果与讨论 2．1 色谱线性范围 分别取5O L5mg／mL的BSA和 1OtxL0．5mg／mL的胰岛素，混合后按照 1．2 节的方法进行衍生反应．样品中胰岛素和BSA的最终质量浓度分别为0．042和2．1mg／mL．将上述样 品逐步稀释，得到一系列质量浓度分别为42．0，21．0，10．5，5．3和2．5 g／mL的胰岛素和2．1，0．42， 收稿 日期：2007-03—13．