低分子量树枝状聚乙烯亚胺-g-黄秋葵多糖作为基因药物合成载体的构建.pdfVIP

江苏农业科学 2013年第41卷第8期 一 39一 阂莉静，李敬芬．低分子量树枝状聚乙烯亚胺一g一黄秋葵多糖作为基因药物合成载体的构建[J]．江苏农业科学，2013，41(8)：39—42 低分子量树枝状聚乙烯亚胺 一g一黄秋葵多糖 作为基因药物合成载体的构建 闵莉静，李敬芬 (湖州师范学院生命科学学院，浙江湖州313000) 摘要：通过合成设计 ，获得 1种转染率高、细胞毒性低、生物相容性好的基因药物合成载体。用水煮醇沉法提取黄 秋葵多糖，纯化 ，键合树枝状聚乙烯亚胺 (bPEI，分子量为600、1200U)，获得 bPEI—g一黄秋葵多糖复合物，并对复合 物进行系列理化生表征。HNMR结果表明复合物合成成功；凝胶阻滞电泳结果表明，在复合物与质粒 DNA重量比在 5：1时，复合物能与质粒DNA牢固结合，且在投射电镜下观察看到，复合物包裹质粒DNA成直径约为200nnl的核 状；细胞毒性试验表明，该复合物毒性远低于PEI一25ku，而细胞转染效率试验结果表明，该复合物转染效率较高，当 重量比为70：1时，与PEI一25ku接近。说明bPEI—g一黄秋葵多糖复合物是一种高转染、低毒、生物兼容的基因药 物合成载体。 关键词 ：低分子量；树枝状 ；聚乙烯亚胺；黄秋葵多糖；合成载体 中图分类号：Q782 文献标志码 ：A 文章编号：1002—1302(2013)08—0039—04 基因治疗有望解决一些 内源性疾病，该过程中基因药物 料有限公司；绿色荧光蛋白质粒 pEGFP—N1均为上海市肿瘤 载体具有极其重要的作用。目前，临床应用的基因药物载体 研究所惠赠；质粒提取试剂盒购 自Qiagen公司；荧光素酶检 主要为病毒性载体，具有易引起免疫反应和基因突变的潜在 测试剂盒购 自Promega公司。COS一7细胞 (非洲绿猴肾上皮 危险u，所以，人工合成的非病毒基因药物载体成为研究热 细胞)培养于含有 10％小牛血清的1640培养基中，由浙江大 点。其中，基于聚乙烯亚胺 (PEI)的阳离子非病毒载体 由于 学肿瘤免疫所赠送。MTr溶液：5mg／mL甲基噻唑基四唑 × 其结构中的胺基能与DNA很好地结合，保护 DNA不被酶降 PBS液，过滤除菌，避光，20℃保存；磷酸缓冲液 (PBS)溶液： 解而获得更多的重视。PEI的转染效率与其分子量成正 比， 8．0 gNaC1、3．478 5g Na2HPO4 ·12H20／2．9 gNaH2PO4、 高分子量的PEI具有高转染率，但细胞毒性也高。目前研究 0．2gKC1、0．2gKH2PO4溶于 1000mL蒸馏水；Tfis一乙酸 表明，PEI一25ku具有最高的转染效率 ，但毒性也最大；低分 (TAE)缓冲液：Tris碱242g、冰乙酸57．1mL、EDTA18．612g 子量的PEI虽然细胞毒性较低，但几乎没有转染率 。目 溶于0．01mol／LPBS溶液中，加水定容至 1000mL。 前，大家都在寻求通过修饰PEI的结构获得低毒、高效的基因 1．2 仪器 药物载体。黄秋葵多糖是从药食两用的植物 一 黄秋葵果实 透析膜 (分子量 8000～14400u)购 自Pierce公司； 中提取的一种天然植物多糖，具有降脂、降压、抗癌、抗热应激 FD一1冰冻干燥机；瓦里安400MHz核磁共振仪 ；U一2800紫 性、抗疲劳等生理活性 。其结构中存在大量的一OH，可 以 外分光光度计；JEM一2100HR透射电镜；SeriesII细胞培养 与低分子量PEI中的胺基通过酯键耦合成高分子量复合物。 箱；BIO—RAD680酶标仪；TanonEpo凝胶电泳仪；JS一380A 一 方面，高分子量的复合物结构将大大提高其细胞转染效率 ； 自动凝胶图像分析仪；NikonEclipseTE200倒置荧光显微镜； 另一方面，该复合物易生物降解，且降解后的产物低毒，细胞 LB9507荧光素酶检测仪 ；恒温摇床 (ThemoForma)；一80℃ 兼容性好。