一步法酵母活性蛋白提取试剂盒One Step Yeast Active Protein.PDF

一步法酵母活性蛋白提取试剂盒 One Step Yeast Active Protein Extraction Kit 品编号：C500026 包装规格：20 Assays 品简介 由于酵母对重组表达的蛋白质有真核细胞相似的翻译后修饰的功能，同时又有培养成本低廉的优点，所以酵母成为研究 蛋白相互作用和真核基因表达的重要工具，因此快速从酵母中提取所需要的蛋白成为一个很重要的步骤，由于酵母有坚硬的 细胞壁，传统的提取采用强碱，使得大多数蛋白产生变性，而玻璃珠法蛋白提取会使得玻璃珠对蛋白产生一定的非特异性吸 附作用，导 蛋白质的损失，该一步法酵母蛋白提取试剂采用一种温和型的非离子去污试剂可在20分钟内从酵母细胞中提取 h 可溶型蛋白，而且绝大多数蛋白可以保持活性，通过对毕赤酵母的可溶型蛋白提取表明，该方法提取效率要高于传统的玻璃 珠法。 c 品特点 e 1. 不需要剧烈的的机械磨碎和长时间的破壁酶对其进行消化，比较合适于酵母胞内表达的重组蛋白的快速筛选。 t 2. 可以从20x50mg 的湿重新鲜或冻存的酵母中提取所需要的可溶性蛋白质，而且绝大多数蛋白可以保持活性。 o 3. 提取的蛋白质可以透析去除离子和去污试剂，或将缓冲液替换为所需要的目的蛋白质的合适缓冲液。 i 4. 该试剂盒所用提取液也可以用于大肠杆菌等G阴性细菌中的可溶性蛋白质的提取。 运输和保存条件 b 请将蛋白酶抑制剂、DTT和PMSF溶液于-20℃保存，提取试剂在2-8℃的条件下保存，该试剂盒保质期一年。 n 品组成 o 成分 C500026 提取试剂 g 20 mL 蛋白酶抑制剂 25 L DTT n 1 mL 蛋白酶抑制剂 a 250 L 操作步骤 s 1. 5000 rpm （2500g ）室温离心2 min，收集处于 数生长期的酵母，去上清，称重潮湿酵母的重量。收集的酵母也可以 -20℃或-80℃的条件下保存，留待以后提取。 2. 按照每50mg 湿重的菌体加入500 L的提取试剂（每毫升的提取试剂加入1 μL的蛋白酶抑制剂和20 L的DTT 和10 L 的PMSF ），用枪头反复吹打均匀。 3. 盖上离心管的盖子，将其放置在脱色摇床上280 rpm室温震荡20min左右。 4. 13000 rpm （15000 g ）离心15 min，收集酵母细胞碎片，将上清转移到一个新的离心管中，作为可溶性蛋白质部分， 此时有60% 以上的可溶性蛋白被提取出来。 5. 如果要进一部增加蛋白质的提取效率，可以按照步骤2-4 的方法再次提取，并合并两次提取所得到的上清。将上清用于 蛋白质分析，纯化或定量。 注意事项 1. 请在实验前加入一定浓度的DTT 和蛋白酶抑制剂到提取试剂中，使得DTT的终浓度为0.02M。 2. 对于毕赤酵母 （Pichia pastoris）和酿酒酵母 （Saccharomyces cerevisiae），请适当提高DTT 浓度到20-100mM，以提 高可溶性蛋白的提取效率或者将温度提高到42°C 的按照步骤3 的方法进行提