高效液相色谱法测定血中游离、结合色氨酸及5-羟色胺.pdfVIP

高效液相色谱法测定血中游离、 结合色氨酸及5-羟色胺 廖卫平* 陆雪芬* 湖（南医科大学附属第一医院神经病学研究室，长沙 410008 5-羟色胺 5（-HT）是体内一种重要的生物活性物 为：Y＝-1.530 2.089X和Y=0.110 1.503X。 质，在神经系统中与递质功能密切相关，周围血中的 电化学检测器工作电位＞0.40V时5-HT即有良 5-HT除其有明显的血管活性外其它功能尚不清楚， 好的响应，以后随电位增高响应稍有增加，但噪音也 但它的测定已广泛用于一些疾病的研究中1。血液中 随之增加。由于血液中成分较复杂，本方法未给予特 的色氨酸 T（rp）作为前体可影响5-HT代谢，同样与许 殊预处理。为减少噪音及其它物质的干扰，检测器工 多疾病有关2；它以游离及结合两种形式存在，两者 作电位设为0.50V。临床分析中证实该条件下足以进 有不同的生理意义。其分离方法有透析3、层析1,2,4 行 5-HT的精确检测。Trp在工作电位＞0.70V时才 超滤5等。我们现报告一种用饱和硫酸铵沉淀蛋白以 出现响应，故本方法采用了紫外检测器进行检测。 分离游离与结合色氨酸，用高效液相色谱 紫（外及电 化学检测器）测定5-HT及Trp的方法。 实 验 部 分 一（）仪器、试剂和色谱条件 332型液相色谱系统 B（eckman公司），色氨酸及 5-HT为Sigma公司产品，其余均为国产分析纯试剂。 UltrasphereTM-ODS反相色谱柱 4（.6mmi.d. 25cm d5m 紫外检测器 （254nm，灵敏度0.02～ 0.08AUFS）检测色氨酸，同时连用电化学检测器 BAS氧化型，工作电位0.50V10 20nAFS）检测5- HT。流动相为0.1mol/L醋酸钠含0.1mmol/L Na2EDTA，与15％甲醇混合后用冰醋酸调pH至5. 20 0.02。 （二）样品处理 取血清0.5ml加入装有0.36g硫酸铵的小塑料 二（）重复性及回收率 三种不同浓度下进行重复 离心管内，加盖振荡后，12000g离心15min，用小针 性和精密度试验，结果如表1。色氨酸的批内和批间 头穿过蛋白层取下层清液0.2ml，微孔滤膜过滤后取 变异系数最大为2.0％和4.6％；5-HT的批内和批间 50l进样，测定游离色氨酸。上层蛋白成分加3.5mol 变异系数最大为4.7％和9.2 /L过氯酸 0.2ml，振荡后离心，取上清液 50l进样， 表15-HT与Trp分析的重复性及回收率 测定结合色氨酸量。血清或（血浆）样品也可如上所述 用过氯酸去蛋白后进样，测定总色氨酸及5-HT。 结果与讨论 一（）色谱图见图15-HT与Trp的保留时间分别为 5.5和 7.0min -HT在10 10000nmol/LTrp在0. 5 100mol/L范围内，浓度与峰高呈良好的线性关 系，其相关系数均大于0.999。其标准曲线方程分别 *现在广州医学院神经科学研究所510260 （三）不同样品中的色氨酸及5-HT值 测定了?例 定了16例无中枢神经系统疾病患儿血中的游离、结 常人不同血样品— 血清、富血小板血浆 P（RP）⒎ 合色氨酸及脑脊液中色氨酸等物质，发现游离色氨酸 血小板血浆 （≒PPP）中的腡Tr 及?5-H浓度，发现不 浓度与脑脊液中色氨酸浓度呈良好的正相关，其回归 样品中Trp浓度差别不大，而5-HT浓度相差很大 表（ 方程为：Y=0.28＋?0.60X，γ?=0468，琍P＜?.05＝ 2），琍PR中?5-H值约为狿PP的?1倍，血清?5-H 合色氨酸或总色氨酸与脑脊液中色氨酸则无明显相 与PRP中5-HT值有 良好的相关性 Y（038X- 1 关性。一般认为正常情况下只有游离色氨酸才能通过 310.47，γ?=0844，琍P＜?.005）。说明血清中的?5- 血脑屏障影响脑脊液中色氨酸浓度，故可认为本方法 主要来源于血清析出过程中血小板的释放。 中测得的游离色氨酸浓度可反映体内游离色氨酸浓 表2 不同样品中的?5-H值（nmol/