蟹源拟态弧菌外毒素的生物学特性分析.pdfVIP

摘 要 近年来随着安徽省河蟹养殖规模的不断扩大，细菌性疾病时有暴发与流 行，其中由拟态弧菌(Vibrio mimicus)引起的弧菌病是影响养蟹业最为常见、 危害性较重的一种疾病，严重制约了养蟹业的发展。因此，加深对拟态弧菌 生物学特性及其致病机理等方面的研究，对于寻找切实有效的疾病防治措 施，振兴水产养殖业具有深远的意义。本实验室从发病河蟹体内分离鉴定到 一株拟态弧菌(HX．4菌株)，并对其致病性进行了初步研究，确定为致病菌。 本课题应用细菌学和分子生物学方法对该菌株外毒素的致病性、最佳产生条 件、提取方法和生物学特性进行了系统研究。旨在为进一步研究该菌的致病 机理和研制毒素疫苗奠定一定的理论基础。 首先，应用动物试验测定拟态弧菌HX．4菌株外毒素的致病性、毒力和 08 肠毒性。分别使用外毒素提取液和活菌体(3×1CFU／mL)接种实验小鼠 和河蟹，结果显示外毒素与菌体对实验动物均有致病性，致死率均为100％， h～10 h～36 但致死时间明显不同，前者为2 h，而后者为24 h。毒力试验结果 示外毒素具有不耐热性肠毒素活性。这些均表明该菌产生的外毒素在其致病 过程中发挥主要作用。 乓次，对拟态弧菌HX．4菌株的最佳产毒条件进行了优化。结果显示培 养基的种类、氯化钠浓度和初始pH，培养温度、培养时间与培养方式等环境 8．O， 参数对细菌的产毒量均有明显影响，其最佳产毒条件是：采用初始DH 含O．5％NaCI的脑心浸液(BHI)培养基，28℃振荡培养36 h或静置需氧培 养48h。 再次，采用固体硫酸铵盐析法和层析技术建立了拟态弧菌HX．4菌株外毒 素的提取方法。研究中对硫酸铵饱和度与离子交换层析洗脱缓冲液pH进行 了优化，结果显示当硫酸铵饱和度为50％时，外毒素总蛋白得率较高，其溶 A50离子交换层析以使用洗脱缓冲 血素和蛋白酶活性最强：DEAE—Sephadex 7．8，O．05 mol／L mol／L的Tris—HCl缓冲液经0-0．6 液为pH NaCI线性梯度洗 脱后所得的外毒素蛋白得率最高，酶活性也最强。根据上述优化的最佳条件， A50离子 细菌培养上清液依次进行50％饱和度硫酸铵盐析、DEAE—Sephadex G．1 mol／L 00凝胶层析(平衡和洗脱液为0．3 交换层析和Sephadex NaCl的DH 7．8，0．05mol／L Tris—HCI缓冲液)，每100毫升培养液可提取0．2 mg外毒素。 性酶成份，并对指示凝胶技术的条件进行了优化。结果显示，外毒素的最佳 蛋白的0．8％琼脂糖平板、含O．4％明胶的0．8％琼脂糖平板和含l％兔红细 h，再用考马斯亮蓝R-250染色， 胞的O．8％琼脂糖平板作指示，移位消化1．0 在蓝色(酪蛋白酶和明胶酶)或暗红色(溶血素)背景下均可见到较清晰的