分子生物学 - 生物化学工程实验教学中心 - 南京工业大学.docVIP

分 子 生 物 学 简明实验指南 （南京工业大学分子生物学实验课使用） 制药与生命科学学院 基因工程实验室 许 琳 教授 2006年2月 编 者 的 话 当前，生物化学与分子生物学理论和技术的发展日新月异，并向生命科学的各个领域纵深发展。越来越多的生命现象需要人们从生物大分子的结构、功能和相互作用即分子水平来深入研究。因此学习和掌握分子生物学实验的理论和技术，将有助于揭示生命规律的科学研究。基于这样的目的，在制药与生命科学学院的领导支持和帮助下，我们基因工程实验室开设了分子生物学系列实验课程。 在南京工业大学分子生物学教学的程中，我们深深感到分子生物学是一门实践性很强的学科，实验教学在分子生物学教学过程中占有十分重要的地位。虽然此学科的实验教材种类较多，但是为了更适合工科专业的学生使用，老师们利用空余时间编写了这本《分子生物学简明实验指南》讲义。由于受到实验时间、经费等各方面的局限，目前开设的实验课相对比较基础，其目的是为大家打下一个良好的基础。由于时间、经验等方面的原因，会有不足之处，期待大家的指正。 我们真诚的希望通过实验教学活动，不断丰富和完善实验教学内容，提高实验教学水平，为我院开展分子生物学实验教学课程有个良好的开端和打下扎实的基础，同时感谢为编写此讲义负出辛勤劳动的荀志金、张宏志、李永建和曹丹燕等同学。 基因工程实验室 许琳、徐爱莲 2005年2月 目 录 §1 氯化钙法大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 1 一、实验目的 1 二、实验原理 1 三、仪器与试剂 2 四、实验步骤 2 五、注意事项 5 §2 质粒DNA的提取 6 一、实验目的 6 二、实验原理 6 三、仪器和试剂 8 四、实验步骤 8 五、注意事项 11 §3 琼脂糖凝胶电泳 13 一、实验目的 13 二、实验原理 13 三、仪器与试剂 13 四、实验步骤 14 五、注意事项 14 §4 细菌基因组DNA的提取 15 一、实验目的 15 二、实验原理 15 三、仪器和试剂 16 四、实验步骤 16 五、注意事项 18 §5 质粒DNA限制性内切酶实验 19 一、实验目的 19 二、实验原理 19 三、器材与试剂 21 四、实验步骤 22 五、注意事项 23 §6 重组DNA的PCR扩增 25 一、实验目的 25 二、实验原理 25 三、仪器与试剂 25 四、实验步骤 26 五、注意事项 28 §7 胶回收法纯化DNA 30 一、实验目的 30 二、实验原理 30 三、仪器和试剂 31 四、实验步骤 31 五、注意事项 34 §8 含甘油培养物保藏法 36 一、实验目的 36 二、实验原理 36 三、仪器与设备 37 四、实验步骤 37 五、注意事项 38 §1 氯化钙法大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 一、实验目的 掌握重组DNA质粒转化大肠杆菌的操作技术。 二、实验原理 带有外源DNA的重组质粒，在体外构建后，需要导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得、纯的重组质粒DNA，满足进一步的DNA序列测定、外源基因的宿主细胞表达、制备探针DNA等需要。含外源DNA片段的质粒DNA导入细菌如大肠杆菌的过程称为转化(transformation)过程。 转化的概念来源于遗传学,细菌细胞的生物学特性由于吸收外源DNA而发生遗传特征改变称为转化。细菌处于容易吸收外源DNA状态称感受态，用理化方法诱导细菌进入感受态的过程称为致敏过程。重组DNA转化细菌技术操作的关键是利用化学试剂诱导细菌细胞进入感受态，以便吸收外源DNA进入细菌胞内。 基因工程技术中最常用的是氯化钙转化技术，虽然对其基本原理仍然不完全清楚，但是比较认同的看法是，细菌处干0℃、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀形成球状，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附与细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，之后细菌在富含营养的培养基上生长，球状细胞复原并分裂繁殖, 重组质粒在转化的细菌中，表达目的基因，因而在选择性培养基平板中，可以选出阳性细菌转化子。Ca++处理的感受态细胞，一般每微克DNA能转化105-106个细菌、环化的质粒DNA 愈小，转化率愈高。环化的DNA分子比线性DNA分子转化率高1000倍。除外，电击法也可用于转化过程，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依赖短暂的电击，促使DNA进入细菌。转化率最高达109-1010转化子/μg闭环DNA。电击法因操作简便也愈来愈被各实验室采用。 为了转化成功，本实验室购买了“北京博大泰克生物基因技术有限责任公司”的“高效感受态DH5a细菌细胞”，可省略制备DH5a感受态细胞的实验步骤，直接进行转化。 三、仪器与试剂 1．隔水式电热恒温培养箱，水浴锅，台式冷冻恒温振荡器，低温离心机，净化工作台。 2．待转