实验方法细胞培养.PDFVIP

實驗方法 細胞培養 : 將 RAW 264.7細胞置於培養皿中以含有 10 % ( v/v ) 胎兒牛血 清的 DMEM 培養液 ( 含 100 U/ml penicillin 及 1 µg/ml streptomycin ) 培養細胞，再將細胞放入細胞培養恆溫箱中，維持 37°C 5%CO2 /95% air ， 溼度 70% ，每隔一至兩天更換一次培養 液；細胞長滿 ( confluence ) 後，以 0.25% trypsin溶液將細胞刮下， 然後以 1:3 至 1:5的比例進行細胞繼代培養。 細胞存活率測定 : 將 RAW 264.7 細胞繼代培養至 24-well plate 待長至八分滿即 可進行實驗；加入 baicalein ( 0.5-5 µM ) 及 LPS ( 2 µg/ml ) 處理 24 小時後，改換成含 0.5 mg/ml MTT 之 DMEM培養液， 於 37°C的 細胞培養恆溫箱中作用 2-3 小時，然後再將上層培養液吸除，加入 200 µl DMSO 將細胞溶解 ，使用 enzyme-linked immunosorbent assay ( ELISA reader )讀取波長 550 nm的吸光值變化 吸光值大小相對， 代 表細胞存活率；其中原理主要是利用MTT在活細胞中會被粒線體 上 的酵素 ( dehydrogenase ) 作用而產生深紫色的 formazan 產物之特 性來測定細胞存活率。 20 西方點墨法 : 1. 細胞萃取液製備 將 RAW 264.7細胞培養於 10 cm dish中，分別加藥處理適當 時間後 ，吸除 上層 培養 液 ，再以 PBS 清洗 2-3 次 ，再利用細胞刮刀 將 dish 上附著的細胞完全刮下，收集於 eppendorf 離心管中，於 4°C ，2500 rpm ，離心 10 分鐘 ，然後吸除上清液 ；之後加入 100 µl lysis buffer 將細胞打碎，再於 4°C ，10000 rpm ，離心15 分鐘，收集 上清液即為 細胞萃取液。 2. 蛋白質定量 細胞萃取液內蛋白質含量使用 Bio-Rad 之 protein assay kit 來 檢測， 用 ELISA reader讀取波長 630 nm 之吸光值。 3. 電泳及轉印 將細胞萃取液加入 sample buffer ( 3:1 ) 於 95°C 加熱煮沸 5 分 鐘 ，將蛋白質 denature後 取 30-50 µg 蛋白質用 10% sodiumdodecyl sulfate-polyacrylamide gel ( SDS) 作垂直電泳分離蛋白質，之 後再將分離之蛋白質轉移至 polyvinylidene difluoride ( PVDF ) membrane 上 ( 15V ， 100mA ， 4 °C ， overnight ) ，最後再 將 PVDF 21 membrane取出，進行免疫染色。 4. 蛋白質免疫偵測 將 PVDF membrane浸泡於含 5% 脫脂奶粉之 TBST中，均 勻 搖晃一小時去除非專一性結合，接著再使用 TBST 清洗 20 分鐘 ，再 依序加入以 TBST 適當稀釋的第一抗體 ( IκBα ，iNOS ，PKCε ， JNK1/2 ，Phospho-JNK1/2 ，p38 MAPK及 Phospho-p38 MAPK )