《生物光子学》 13 振动吸收峰的种类.ppt

修正的比尔-朗伯定理 总衰减截面： 总衰减系数： 对于足够薄的生物样品，如细胞，散射所导致的光程增加可忽略，则： 绝大多数生物样品同时具有吸收和散射效应，则： 对于厚的生物样品，如生物组织，散射所导致的光程增加不可忽略，则： 背景引起的损耗 路径因子，用以描述散射引起的光程加长 由生物组织出射的光子的分类 提高高散射生物样品中成像深度的方法： 选择合适的光波长，降低散射效应 在组织中加入适当的清透剂，使组织内部的折射率相对匹配 Olympus公司清透剂 WD: 4 mm or 8 mm 小鼠大脑孵育清透剂两周前后 CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails) COCKTAIL: chemical mixtures containing aminoalcohols mCherry EGFP Neuron-YFP Cell 157, 726–739 2014 非弹性散射：拉曼散射 拉曼散射（Raman Scattering）是指当光通过介质时与分子发生相互作用而引起的频率发生变化的非弹性散射。 印度物理学家C. V. Raman 1928年发现拉曼散射， 1930年因此获得诺贝尔物理学奖 当处于在基态（E0）的分子受到能量为hν0 的入射光子碰撞时，由于介质分子以某个频率νm振动或者转动吸收了入射光子的一部分能量，这时辐射出的散射光（ hν0 -hνm ）叫做斯托克斯线，光子能量变少，波长发生红移 若分子处于激发态（E0+ hνm），碰撞过程中介质分子释放出一部分能量，则辐射出反斯托克斯线（ hν0 +hνm ），光子能量变大，波长发生蓝移。 遵守波尔兹曼分布定律，反斯托克斯线的强度比斯托克斯线弱 当入射光子和分子相碰撞时，分子的振动能量或转动能量和光子能量相叠加，因此利用拉曼光谱可以把处于红外区的分子能谱转移到可见光区来观测，反映了分子的结构和振动，也是一种指纹光谱。 增强拉曼光谱的方法 自发拉曼散射非常弱，大约一百万个光子中才有一个作用产生拉曼光子。如何提高拉曼散射的强度？ 共振拉曼散射 增大102－106倍 荧光背景噪声 特定波长激发 表面增强拉曼散射 （SERS） 增大104－1012倍 克服荧光背景噪声 引入新的金属材料 受激拉曼散射（SRS） 相干反斯托克斯拉曼散射（CARS） 增大约105倍 低背景噪声 无需引入金属材料 系统复杂 针尖增强拉曼散射 （TERS） （增强）拉曼光谱在生物光子学中的应用 生物分子传感 拉曼编码 生物成像 生物医学诊断 3.3 生物样品发光(luminescence)效应 自发发光 激励发光：光致发光(photonluminescence)，电致发光， 声致发光，化学发光 荧光(fluorescence) 磷光(phosphorescence) 单重态和三重态 单重态 (singlet, S)：同一轨道上的电子具有相反方向的自旋 单重激发态 (S1, S2…)：被激发的电子在新轨道中的自旋方向和（自己）原来相同 三重激发态 (triplet, T1, T2…)：被激发的电子在新轨道中的自旋方向和（自己）原来相反 三重态(T)具有比单重态(S)更低的能量和更大的激发态寿命 荧光和磷光的产生机制 无辐射跃迁：指以放热的形式将多余的能量辐射给周围环境 辐射跃迁：指以放光（荧光、磷光）的形式将多余的能量辐射给周围环境 Jablonski能级图 荧光光谱的特点 发射光谱形状和吸收光谱的形状极为相似， 并呈现“镜像”现象 荧光发射波长总是比激发波长稍长—单光子 发射光谱的形状和激发光的波长无关 荧光发射的强度和激发光的波长有关 表征荧光的参数 荧光发射光谱 荧光激发光谱 不同激发波长的激励引起荧光剂发射同一波长相同荧光强度的相对效率 荧光量子效率 (quantum yield) 内部因素：分子内可进行能量转换的振动能级的数目等 外部因素：荧光分子所处的环境 荧光寿命 脉冲激光激励下，荧光辐射由其本来强度衰减到1/e 时所需要 的时间，称为荧光寿命，用? ?表示。 荧光强度