以双向电泳为基础的肺癌组织差异蛋白分析策略.doc

以双向电泳为基础的肺癌组织差异蛋白分析策略 靳 胜，张 曼，张秀敏，许华林，张 敏，郝 林　（北京世纪坛医院临检中心，北京 100038） 摘 要: 目的 优化肺鳞癌组织双向电泳方法，进行蛋白图谱差异分析，为鉴定肺鳞癌癌变相关蛋白奠定基础。方法 收集癌组织以及癌外周组织标本，通过优化参数和方法应用双向电泳技术分离组织总蛋白，比较差异蛋白。用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱得到相应的肽质指纹图谱（PMF），搜索数据库鉴定。结果 获得了分辨率高、重复性好的双向电泳图谱，得到了若干与细胞增生、分化、周期调控或肿瘤发生有关的蛋白。结论 建立了肺鳞状细胞癌组织的双向电泳方法。 关键词：双向电泳；肺鳞状细胞癌组织；蛋白质组 肺癌是全球高发肿瘤之一,目前对肺癌的的研究多数是针对单个基因和蛋白的分析,缺乏整体水平的研究,而蛋白质的功能往往是多种蛋白质共同作用的结果。近年来以双向凝胶电泳和质谱技术为基础的蛋白质组学手段在肿瘤研究中受到越来越多的重视[1]。我们将此技术应用于肺鳞癌组织的的差异分析,以发现肿瘤相关的差异蛋白表达,为了更好的显示蛋白的差异表达我们利用多种PH区间的预制干胶条对其进行了比较分析，得到了较稳定可靠的表达图谱；并进一步对若干差异蛋白点进行了肽指纹图谱鉴定，希望为探讨肺鳞癌癌变机理及筛选特异性标志物打下方法学基础。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 组织 人肺鳞癌和癌周组织为本院肿瘤中心2004年9月至2006年7月手术标本，经病理诊断分型，其中癌周标本6例，癌浸润组织标本6例。 1.1.2 试剂 二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒、两性电解质为伯乐公司产品，二硫苏糖醇（ DTT）、碘乙酰胺（IAA）、考马斯亮蓝购自 Sigma公 司，固相pH（酸碱性）梯度干胶条(IPG，Strip3－10，Strip4－7，Strip7－10，11cm）。 仪器 BIORAD公司PROTEAN IEF Cell等电聚焦仪、PROTEAN Ⅱ xi 2-D Cell垂直电泳槽、GS-800 Calibrated Densitometer凝胶成像系统，用PDQuest2D分析软件进行凝胶图像分析。 方法 1.2.1 组织标本的获得以及处理 准确判定肿瘤和正常组织以肿瘤的活跃区为重点。取材后立即处理 作者简介：靳 胜，男，河南开封市人，硕士，主管技师，主要从事肿瘤的多药耐药机制及其逆转方面的研究，发表论文6篇。电话：（010E-mail：js14446@ 通信作者：张 曼，电话：（010Email：manzhang1962@ 收稿日期：2008-05-22；修回日期：2008-07-01 1.2.3 双向凝胶电泳 等电聚焦（Isoelectric focusing,IEF）参照BIORAD公司操作指南进行，取pH 3～10，pH 4～7，pH 7～10的11 cm预制胶条分别进行电泳分析。IEF后取出胶条分别于第1，2步平衡液中振摇15 min,将平衡后的胶条移至12％的凝胶上端SDS垂直电泳，考马斯亮蓝R250染液（考马斯亮蓝质量体积比0.25％,甲醇50%，醋酸10％）染色过夜，然后脱色直至背景清晰。 1.2.4 图像分析 利用GS-800 Calibrated Densitometer凝胶成像系统获取图像，用PDQuest2D软件对图像进行背景消减、斑点检测、匹配以及斑点位置重复性分析。 1.2.5 胶内酶解制备样品 用剪刀将200 μl Eppendorf吸头尖端剪掉约0.3 cm，用剪断后的吸头从凝胶上戳取蛋白质点，转入200 μl离心管中，每管中加入50 μl脱色液（50％乙腈，25 mmol/L碳酸氢钠）；室温放置30 min，吸去脱色液重复以上步骤直至凝胶无色透明。抽真空离心干燥30 min至白色颗粒状，加入10 μl（浓度为10 ng/μl）溶于25 mmol/L碳酸氢钠溶液的胰蛋白酶（promega公司，测序级），37℃孵育30 min，吸去多余液体每份标本再加入8μl的5％三氟乙酸（ACROS公司），37 ℃孵育1 h，将液体吸净转入另一新离心管中；再次加入8μl的2.5％三氟乙酸／50％乙腈，37 ℃孵育1 h，将液体吸净与上次所得液体合并；抽真空离心干燥样品，用2 μl的0.5％三氟乙酸充分溶解肽段进行质谱鉴定。 1.2.6 据库查询 将质谱结果在互联网上用MASCOT软件在相关数据库进行肽指纹图谱分析查询检索(), 肽指纹图谱允许误差0.3 D，相对分子质量允许误差±20％，物种人类。 1.2.7 统计学处理 数据以x±s表示，应用SPSS10.0软件对胶蛋白数目进行t检验。 2 结果 2.1肺鳞癌组织的双向电泳结果以及图谱： 肺鳞癌组织pH 3～