《分子生物学》课件-分子生物学实验.pdfVIP

分子生物学实验 有关实验报告的书写 1、封面： • 分子生物学实验报告 • 班级 • 姓名 • 学号 2、内容： • 实验的名称，如： 实验一、真核细胞基因组DNA的提取 • 实验 目的 • 实验原理 • 实验用品 • 实验步骤 • 试验结果及分析 实验一 质粒DNA 的分离纯化 碱裂解法提取质粒DNA 一、实验 目的： 掌握碱裂解法提取质粒DNA 的原 理与方法，了解各种试剂的作用。 二、实验原理： • 从细菌分离质粒DNA的方法都包含3个基本步骤： 培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离 和纯化质粒DNA。碱变性法抽提质粒是基于染 色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到 分离目的。 二、实验原理： • 将细菌悬浮于葡萄糖等渗液中，经EDTA、NaOH- SDS溶 液处理，可破坏菌体细胞壁和细胞膜，使细胞崩解 • NaOH破坏核酸碱基对使氢键断裂，细菌染色体DNA和质 粒DNA变性 • 但质粒超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完 全分离，所以当以pH4.8的KAc高盐缓冲液调节其pH至 中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，重新形 成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中 二、实验原理： • 而线状染色体DNA片段难以复性，与不稳定的 大分子RNA、蛋白质-SDS-细胞膜复合物缠绕附 着在细胞壁碎片上，冰浴后易沉淀，可离心除 去 • 通过氯仿/异戊醇等有机溶剂除去蛋白质，再 用乙醇等有机溶剂沉淀DNA，即得纯化的质粒 DNA。 三、实验用品： 如试剂: • ◆ 溶液 Ｉ （葡萄糖维持渗透压、Tris－HCl 维持pH 值、EDTA 抑 制核酸酶） • 50mmol/L葡萄糖 • 25mmol/L Tris．Cl(pH8.0) • 10mmol/LEDTA (pH8.0) • ◆溶液Ⅱ （NaOH裂解细胞与核酸变性、SDS裂解细胞与蛋白质变 性） • 0.2mol/L NaOH （临用前用10mol/L贮存液现用现稀释） • 1%SDS • ◆溶液Ⅲ （乙酸钾置换钠离子、冰乙酸调节pH 值） • 5mol/ Ｌ乙酸钾 60ml • 冰乙酸 11.5ml • 水 28.5ml • 异丙醇、无水乙醇、蒸馏水 四、实验步骤： （一）细菌培养和收集 • 将含有质粒的Ecoli菌种接种在LB固体培养基 （含50 μg/ml Amp）中，37oC培养12~24小时。 用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB液体培养基 （含50 μg/ml Amp）中，37 oC振荡培养约12小 时至对数生长后期。 四、实验步骤： （二）质粒DNA的少量快速提取 （碱法） • 1．取1.5ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中，12000r/min 离心 1min。 弃上清，倒置片刻，使液体流尽。 （可重复步骤1一次，以收集较多菌体） • 2．菌体沉淀重悬于200 μl溶液 Ⅰ中，剧烈振荡使菌体充分重悬，加入新 配制的溶液Ⅱ200 μl，盖紧管口，立即将离心管缓慢颠倒数次直到溶液变 清亮 (千万不要振荡)。 四、实验步骤： （二）质粒DNA的少量快速提取 （碱法） • 3．加入200 μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，缓缓颠倒离心管数次直到白色 沉淀充分形成，冰浴5min，12000r/min离心5分钟。 • 4．上清液移入干净eppendorf管中，加等体积的氯仿/异戊醇 （24:1）， 混匀，放置片刻。12000r/min离心5分钟。 （不做） 四、实验步骤： （二）质粒DNA的少量快速提 取 （碱法） • 5．将水相移入干净 eppendorf管中，加入0.6 倍体积异丙醇