人胚胎干细胞全机械法建系及分化为神经细胞之研究.docVIP

　　人胚胎干细胞全机械法建系及分化为神经细胞之研究 第一章 绪论 1.胚胎的 目前建立的 hES 细胞株主要于临床进行体外受精－胚胎移植(in vitrosperm injection，ICSI)治疗的患者捐赠的多余废弃的新鲜或冷冻解冻后的胚胎。一般认为，高质量的含有一定 ICM 细胞数量的囊胚才可能得到生长快速的原代克隆并传代，建系机会高，不过最近的研究使得这一传统观点经受考验，Susnnne 等人在 2002-2009 年的 7 年间对 234 枚囊胚评分并分离 ICM 建立 hES 细胞系后比较发现，囊胚的质量虽然与移植后的怀孕率有关但与 hES 建系成功率没有必然联系,即使质量再差甚至看不到 ICM 的囊胚也能获得 hES 细胞系[5]；另有研究表明，虽然 hES 由分离出来的 ICM 建系而来，ICM 的细胞数量与 hES 建系效率直接相关，但是 ICM 的形态学质量并不是评判 hES 建系效率的指标，建系成功率似乎与胚胎整体的质量关系更为密切[6]。由于囊胚建系的方法是直接破坏囊胚，因此研究人员试图寻找不从囊胚阶段建立 hES 细胞系的方法。2006 年，Irina 等率先在《自然》上发表从卵裂球建立hES 细胞系的研究成果。研究人员将 8-10 细胞时期的胚胎去除透明带后，机械分割成多个单卵裂球，与绿色荧光标记的 hES 克隆共培养，直到单卵裂球分裂长出 hES 样克隆[7]。此后几年，相继有不少科学家报道从卵裂球胚胎分离单卵裂球成功建立 hES 细胞系的成果[8-10]。已有报道称，通过培养胚胎活检获得的单卵裂球建立 hES 细胞系，并且经过优化胚胎培养和建系的条件后建系成功率可达到50%[11]。 2.囊胚培养条件的优化 鉴于目前建立 hES 细胞系的囊胚为废弃的胚胎，胚胎的质量没有保证，有些甚至无法发育至囊胚阶段。人们发现改变辅助生殖实验室惯用的囊胚培养条件，对培养方法进行改良之后能提高 hES 建系的成功率，Fan 等在囊胚培养体系中添加人重组白血病抑制因子和成纤维细胞生长因子，使得低质量的胚胎发育成囊胚以及建立 hES 细胞系的成功率分别提高两倍和七倍[12]。Liu 等将去除透明带后的囊胚分别以多胚胎聚合物、单个胚胎和卵裂球形式培养，结果发现多胚胎聚合物的生长情况和 hES 建系得率最高[13]。 3.分离 ICM 的方法 由于囊胚滋养层（trophectoderm, TE）在体外生长速度快于 ICM，TE 过度增殖会抑制 ICM 生长，因此去除 TE 有利于 ICM 在体外增殖。去除 TE 分离 ICM 的方法主要有免疫外科法，机械法，全胚胎培养法和激光法。 3.1免疫外科法 免疫外科法是使用最为普遍的方法[14]。自 1998 年 Thomson[4]等用此法从人类囊胚期胚胎中分离出 ICM 并首次成功建立 hES 细胞系后，许多研究者用此法也建立了多株 hES 细胞系。免疫外科法的基本原理是先用酶解法脱掉囊胚透明带，再利用兔血清和豚鼠血清的抗体和补体使囊胚的滋养层细胞发生免疫溶解，从而得到 ICM 细胞。此法可以完整地去除 TE 细胞，并且 ICM 细胞生物活性基本上不受影响。但是由于此法用到动物的抗体和补体，使 ICM 遭受了潜在的污染，对hES 的应用特别是临床应用来讲免疫外科法不是理想的方法。 3.2 机械法 2007 年，瑞典科学家首先报道了用一种特制的针状工具，机械法分离 ICM并成功建立 hES 细胞系的有效方法[15]。之后，Li 等仅用普通的 1 ml 注射分离 ICM并成功建系，是一种高效，经济，省时且无污染的理想方法（图 1.1）[16]。机械法可完全避免接触动物蛋白，成本低，其优势较明确，但是对操的操作熟练程度要求较高，需练习后才能掌握。 3.3. 全胚胎培养法 由于目前真正用于 hES 研究的胚胎大多数是由于质量较差而被捐献的胚胎，许多囊胚可能形态不是很好，ICM 很小或不明显，这样就给免疫外科法和机械分离法带来困难。Kim 等[17]将此类胚胎经过自然孵化或酶解法脱掉透明带后直接接种于饲养层细胞上，通过反复传代提出 TE 细胞和已分化的细胞，并成功建立了hES 细胞系。该方法的优点是操作简单、分离过程无动物源物质污染。但是由于未去除 TE 细胞，需要经过更多代数的传代纯化才能建立 hES 细胞系，建系效率较低。 3.4. 激光法 2008 年，Cortes 等人用激光打孔破坏滋养外胚层的方法提高小鼠 ICM 分离和 ES 细胞建系的效率[18]，很快激光作为代替免疫外科法的方法同样被用于分离人 ICM 并且 hES 建系成功[19]。激光法分离 ICM 无异源污染，但是对设备成本和操作的熟练程度要求较高，建系成功率目前尚不明确。 第二章 材料与方法 1.实验材料 人类胚