大豆子叶节遗传转化体系的优化及大豆异黄酮相关合成酶基因转基因大豆的鉴定.docVIP

　　大豆子叶节遗传转化体系的优化及大豆异黄酮相关合成酶基因转基因大豆的鉴定 第一章 绪论 1.1植物遗传转化技术 植物遗传转化，主要是应用重组 DNA 技术、细胞组织培养技术等将外源基因或 DNA 通过某些途径插入到受体基因组中，并使其在转基因植株中得到稳定表达的一项农业生物技术[1]。在七十年代初，研究者的注意力开始转移到植物转基因方面，但是一直到八十年代左右才有了新的发展，转基因烟草的问世极大地促进了人们对分子转基因技术的应用和农作物新品种培育方面的研究。时至今日，利用转基因技术已成功获得了超过 200 种的农作物。而在这短短的几十年内，植物遗传转化技术发展如此迅速，归纳起来，可将植物遗传转化技术分为载体系统转化的农杆菌介导法[2-3]；直接遗传转化的基因枪法(微粒轰击)[4-5]、PEG 法、花粉管通道法、显微注射等方法[6]。1988年Hinchee[7]报道的使用农杆菌介导转化大豆子叶节，使其对卡那霉素和草甘膦产生抗性，此报道对基因工程在大豆中的应用奠下了良好的基础，在大豆转基因中常用的转化方法是农杆菌介导转化法和基因枪法。农杆菌介导的遗传转化方法，它的原理就是使受伤植物的伤口在自然状态下被农杆菌侵染后将质粒上的片段 T-DNA 转移到植物上，然后诱导使 T-DNA 整合到新的植物基因组上，使其在转化的植物细胞体内完成表达。通常所说的土壤农杆菌为革兰氏阴性杆状细菌，是属于根瘤菌科(Zhizobiaceus)的细菌。应用在植物基因转化的主要指两类细菌，一种是根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens），另外一种是发根农杆菌（Agrobacterium rhizogens）[8]。根癌农杆菌是一种含有Ti 质粒并且可以诱导植物细胞产生冠瘿瘤的细菌[9]，而发根农杆菌则是一种含有Ri 质粒并且可以诱导植物细胞产生发状根的细菌。 .. 1.2大豆遗传转化的再生系统 基因工程中的遗传转化技术就是对外植体进行组织培养的过程，良好的组培过程的提高再生的基础。由于大都是双子叶植物，而且再生、基因型依赖等问题严重，因此大豆基因工程一直存在障碍。在农杆菌介导的大豆遗传转化研究中，大豆的再生受体系统主要有以下三种类型:大豆体细胞胚发生再生系统，大豆不定芽器官发生再生系统和原生质体再生系统。大豆体细胞胚胎的发生途径机制一般包含两类，一种是未成熟的大豆胚，另一种是大豆未成熟的子叶节。一般情况下，农杆菌的转基因技术应用在这两类的上比较多。用 70%的乙醇灭菌后进行侵染，外植体直接分化出胚或在筛选之后获得体细胞胚，进而脱分化成愈伤组织后长出不定芽、不定根等器官，在进一步长为再生植株。Christianson 等[33]在 1983 年以幼胚为外植体，首次通过体细胞胚途径获得了大豆再生植株；随后 Ranch[34-35]等对以 2，4-D 的不同浓度诱导下的外植体生长做了细致优化和对比。Lazzeri[36]等也用 NAA 诱导了大豆幼胚子叶的体细胞胚胎的再生作用。以未成熟的胚胎作为外植体建立的系统已经有了抗草甘膦、潮霉素的大豆，抗苏云金杆菌（BT）大豆。未成熟胚的最大优点为转化率和嵌合体少等。在 1987 年，Parrott[37- 38]等研究人员在发现了大豆未成熟子叶节具有再生能力。在此以后，又相继利用 EHA101 等菌株介导侵染未成熟的子叶节，得到转基因大豆，但是转化率却很低。 . 第二章 大豆子叶节遗传转化体系的优化 2.1 材料 2.1.1 基因材料和植物材料 研究所选取的植物材料为大豆品种吉林 47，取自本研究室。实验中所使用的 IFS2、CHS8 和 CHIⅡ基因植物表达载体的构建是由本实验室闫帆、陈红地与钱丹丹完成[129-130]。 2.1.2 农杆菌菌种 农杆菌转化植株为 EHA105-IFS2、EHA105-CHS8 和 EHA105-CHIⅡ均由本实验室保存。 2.1.3 培养过程 相关培养基培养过程相关培养基请参考[131]。 2.1.4 激素和生化试剂 本研究中所用的激素和生化试剂见表 2.1 .. 2.2 方法 首先挑选大豆成熟籽粒，保证每个种子大小一致并且饱满，种皮光滑没有伤口，将挑选好的种子放培养皿中并置于干燥器内，同时放入加有 54 ml 蒸馏水和44 ml 次氯酸钠，并沿烧杯壁缓慢加入 4ml 浓盐酸，快速关闭干燥器并同时打开通风橱进行种子消毒灭菌处理 10~12h。灭菌后快速取出培养皿盖上培养皿盖，放在打开吹风的的超净工作台内吹掉残留的氯气。采用不同萌发方式对大豆进行萌发培养。选取无菌水侵泡 16h，液体营养液浸泡 14h 和固体培养基萌发 1d 的萌发方式和条件。萌发一天的固体培养基中加入 0.5%琼脂粉，使大豆种子在一天时间内充分润湿萌发便于切取外植体，液体培养基为不加琼脂粉的萌发