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　　家蚕祛毒酶基因表示调控分析 第一章文献综述 第一节昆虫解毒酶研究进展 在自然界中，生物体不断地与外界环境进行物质交换，以满足自身的生长、发育和生存需要。在这些物质中，有些是为了满足生物体营养所需，对生物体是有益的；有些却对生物体的生命有危害。为了生存，生物体必须具备一定的生理、生化，甚至是行为适应能力。通过体内的解毒酶系统催化分解代谢产物或异源物，起到解毒作用，则是生物体主要且常见的一种适应机制。昆虫的解毒酶是一类异质酶系，能够代谢大量的内源或外源底物，这些解毒酶系主要包括：细胞色素 P450 酶系、谷胱甘肽-S-转移酶( GST) 和酯酶（如乙酰胆碱酯酶，羧酸酯酶）等。 11 细胞色素 P450 的结构与功能 1.1.1 细胞色素P450的结构细胞色素 羧酸酯酶超家族是由各种功能多样性的蛋白组成的，它广泛存在于多种生物中[80-83]。它能有效水解羧酸酯类成为相应的醇类和酸类[84]。哺乳动物羧酸酯酶属于 I相药物代谢酶，其主要功能为催化酯类、酰胺类、氨基酸酯类和具有相似结构的药物和前体药物的水解[85-88]。在昆虫中，羧酸酯酶一直被认为是涉及杀虫剂抗药性的一类重要的代谢酶类[89-92]，但随着对昆虫中鉴定到的越来越多的羧酸酯酶的结构及功能的研究，羧酸酯酶在昆虫中的多样性功能也逐渐被认识到。据报道，目前在黑腹果蝇和冈比亚按蚊中分别鉴定了 35 和 51 个羧酸酯酶基因[93]，在西方蜜蜂中鉴定了 24 个羧酸酯酶基因[94]。通过基因组分析和预测，在家蚕中鉴定了 76 个推定的羧酸酯酶基因[95, 96]，其中，大多数的羧酸酯酶都具有组织表达特异性。P450 是以硫醇盐结合血红素为活性中心催化氧原子转移的氧化还原酶，需要亚铁血红素(HEM)活化氧。活性中心HEM 的铁离子一侧与半胱氨酸的硫络合，另一侧可与水中的氧分子络合。细胞色素P450 中绝对保守的半胱氨酸与催化活性中心亚铁血红素中铁元素形成硫醇盐离子键，成为铁的一个配体[5]。这正是细胞色素P450 中的铁能与一氧化碳络合，并在450 nm 存在特征吸收的原因，最初名称也由此而来。不同种属间细胞色素 P450 的序列差异较大，但其三维结构高度保守，所有细胞色素 P450 都基于序列维持整个结构折叠弯曲的相似[6]。通常 P450 有 4 个 beta;-折叠，大约 13 个 alpha;-折叠，其中 beta;5 是可变的。P450 保守的结构核心是围绕血红素周围的蛋白的中心，由螺旋束 D、E、I、L 及螺旋 J、K 组成[7]。总之，高度变异的 P450 蛋白既有高度保守的核心区域，也有与底物识别、底物结合以及与还原酶搭档结合相联系的可变区域。随着对不同细胞色素 P450 氧化酶的空间结构(血红素的结合位点、氧结合部位及底物结合部位等)的研究与比较，不仅将有助于对 P450 结构和功能关系的进一步了解，而且还有助于人们可以修饰 P450 的分子结构以代谢特定的底物，从而产生需要的有用化合物。 第二章材料与方法 第一节材料 克隆用 E.coli 菌株 Top10 由本实验室保存；DH10BacDelta;EGT 由镇江蚕业研究所提供，其中含有的 AcNPV Bacmid 的 EGT 基因已经被敲除，同时保留了 Tn 转座 Helper质粒。转移质粒 pFHNLuc-A3RL 由上海生化所提供，于 pFastBacHTa (Invitrogen)，其中的多角体蛋白启动子已经被缺失；所用其他常规质粒均由本实验室保存。家蚕卵巢细胞系（BmN）由本研究室保存，sf9 细胞由江苏科技大学提供。RTase M-MLV (RNaseH-)、RNase Inhibitor、Ex Taq 酶、RNAiso reagent 总 RNA抽提试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；限制性内切酶 BglⅡ、HindⅢ、Sac I、Sal I、Kpn I 和 Xho I 购自 Fermentas 公司，T4 DNA Ligase 购自 MBI 公司；质粒抽提试剂盒、PCR 产物纯化试剂盒和 DNA 凝胶回收试剂盒购自上海生工生物科技有限公司（sangon）。称取蛋白胨 10 g，酵母抽提物 5 g，NaCl 10 g，加双蒸水至 800 mL，摇动容器至完全溶解。用 5 mol/L NaOH（约 0.2 mL）调节 pH 值至 7.0，加入双蒸水至总体积 1 000mL，高压下蒸气灭菌 20 分钟。LB 固体培养基，高压灭菌后冷却至 60 ℃左右加入相应的抗生素，铺制平板。在冰上解剖各样本的组织器官，取约 100 mg 组织加 1 mL TRNzol 液在液氮中研磨成粉末，室温放置 5 min；4 ℃下 12 000 r/min 离心 15 min；上清液按每毫升 TRNzol液加入 0.2