安全高效的肿瘤基因诊治重组腺病毒载体构建.docVIP

　　安全高效的肿瘤基因诊治重组腺病毒载体构建 第一章 前言 1.1腺病毒相关知识简介 腺病毒（adenovirus）由 Roan 等人又在人和其他动物体内分离提取到相似的病毒错误！未找到引用源。。由于此类病毒最初是由腺体中分离而得，所以经采纳了 Enders 等人的意见国际病毒命名委员会在 1956年将此类病毒正式命名为腺病毒。腺病毒（adenovirus，Ad）是一种呈 20 面体对称，直径在 70nm 到 100nm左右的无包膜的双链 DNA 病毒。整个病毒衣壳上面规则的分布着 240 个六邻体（hexon），它们由非顶角壳粒与其周围的相邻衣壳颗粒组成，以及二十面体 12个顶点处的五邻体（penton）错误！未找到引用源。。每个五邻体上面有一条向外伸展的纤毛（fiber）长度大约在 10 到 30nm 之间。五邻体及其上面附着的小肽和纤毛在病毒与细胞上的受体结合过程中起到非常重要的作用，病毒的种特异性和亚属特异性就由纤毛的抗原决定簇决定错误！未找到引用源。。五邻体基底具有毒素样活性，能引起细胞病变，具有同组共有的 beta; 抗原。六邻体蛋白是构成病毒二十面体颗粒结构的主要蛋白，上面附带了有主要的血清型和群特异抗原决定簇和亚群特异性抗原决定簇。六邻体蛋白具有组特异性 alpha; 抗原错误！未找到引用源。。六邻体蛋白的不同血清型的特异性使得其对一些特殊的因子，如凝血因子 X 等具有不同的结合能力，在病毒入侵一些宿主细胞的过程中起到了重要的作用，因此也成为了近年来科学研究的重要方面错误！未找到引用源。 1.2 腺病毒感染细胞的过程 1.2.1 粘附和进入细胞 腺病毒感染宿主细胞的过程起始于病毒与宿主细胞表面的结合过程，不同组织间病毒与细胞表面结合的方式存在着差异。在大多数组织中病毒通过 5 邻体上的纤维蛋fiber与宿主细胞表面的病毒的特异性受体――柯萨奇受体（coxsackieand adenovirus receptor, CAR）结合，形成紧密的 fiber-CAR 的这种类似钥匙和锁头的结合模式错误！未找到引用源。。与此同时，五邻体基底上的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp, RGD）基序，同宿主细胞表面常存在的异源二聚体整合素受体（integrin）alpha;Ⅴbeta;3和 alpha;Ⅴbeta;5相互作用，促进病毒和宿主细的表面受体形成复合物，利用细胞介导的内吞作用完成病毒内化过程错误！未找到引用源。。该内化方式涉及到 fiber 与 CAR 的结合以及 RGD 基序与整合素受体结合在内的两个结合过程。CAR 受体各种组织之中都有分布，不过不同组织中 CAR 受体的表达量不同错误！未找到引用源。。人体中，CAR 在心脏和胰腺中表达最强，卵巢等组织相对较弱，肝组织中表达比较多。CAR 受体在一些如肺癌细胞系及 Hela 细胞系等一类的癌组织中也表达强度也比较高错误！未找到引用源。。 第二章 实验材料和方法 2.1 材料、仪器和试剂 菌种 DH5alpha; 扩增大片段质粒 实验室冻存菌种 T op10 扩增常规大小质粒 实验室冻存质粒 pShuttle 穿梭质粒 BD 公司质粒 pRSETB 穿梭质粒 Invitrogen 公司质粒 pGEM-TEasy 连接载体 Invitrogen 公司质粒 Ad5－gagpol 连接载体 实验室冻存细胞 HEK293 人胚肾细胞 中国科学院细胞库细胞 A549 人小细胞肺癌细胞 中国科学院细胞库细胞 Caco-2 人结肠癌细胞 中国科学院细胞库细胞 E 人鼻咽癌细胞 中国科学院细胞库细胞 HepG2 人肝癌细胞 中国科学院细胞库细胞 NCI-H1975 肺腺癌细胞 中国科学院细胞库细胞 SKOVCAR3 卵巢癌细胞 中国科学院细胞库细胞 NCI-H1299 人非小细胞肺癌细胞 中国科学院细胞库细胞 Ragi 人淋巴瘤细胞 中国科学院细胞库细胞 HL-7702 人肝正常细胞 中国科学院细胞库细胞 Hela 人宫颈癌细胞 中国科学院细胞库细胞 ZR-75-30 人乳腺管癌细胞 中国科学院细胞库动物 BALB/c(-/-) 裸鼠 中国生物制品所 2.2 实验方法 2.2.1 质粒的小量提取碱裂变法 （1）挑单菌落到含有对应抗性的1.5mlLB液体培养基中，37℃震荡培养过夜。 （2）取1ml步骤一的菌液，装于1.5ml离心管中，13,400xg离心1分钟，尽量吸除上清，收集沉淀。 （1）向离心过后含有剩余菌体沉淀的Eppendorf管中加入已经加过RNaseA的Buffer P1溶液250mu;l，充分重悬沉淀。 （2）向Eppendorf管中加入250mu;l的Buffer P2，温和地上下颠倒混匀4到6次，使菌体充分裂解，至菌液变澄清粘稠。 （3）向Eppe