文心兰OnAC02与OnERSl基因的克降及表达分析.docVIP

　　文心兰OnAC02与OnERSl基因的克降及表达分析 1.引言 1.1文心兰简介 文心兰属气生根发达，多为附生植物，也有一些是地生种类。文心兰属复莲性气生兰类，其假球莲具有椭圆形、卵圆形、圆形、纺锤形或扁圆形等形状。假球莲主要负责养分供给及储存，营养生长时它不断增大，在生殖发育过程中它会因供给养分而缩小。其叶片1-3枚，叶片似短剑，属剑叶种。文心兰花形优美奇特，其花序分枝性好，花色亮丽。整朵花呈左右对称分布，花萼和花瓣各三片。外轮花萼中，顶端的称顶萼或上萼，位于下方两侧的称侧萼；在三片花瓣中，顶萼两侧的为花瓣，位于最下面花型最大的是唇瓣，其形状颜色与两个侧瓣大不相同。中间是森柱，包括雌藤和雄森，有两个花粉块，其上有花药盖，蔬柱两侧各有一枚耳状的翅，整个称为合森柱（石乐松，2014)。其花瓣的鲜艳颜色可以吸引来昆虫，达到虫媒授粉的目的。开放的鲜黄色小花在微风的吹拂下，其顶萼如同头部，两侧瓣像手，下端的大唇瓣如图衣裙，整体看来像一个舞女在翩翩起舞，姿态优美动人，故又叫舞女兰、跳舞兰等，是洋兰类的新宠（马荣华等，2001;胡玉佳，1990)，也被誉为切花五美人之一。文心兰因多为气生根，与大多数花丼植物差别很大，再加上品系十分复杂，即使相同品种的兰株，其生理特性也有差异，所以栽种起来要特别注意。据相关研究，以下因素对文心兰影响颇大，主要有：温度、风速、相对湿度、光周期，根部透气与保水性、PH等。据有关人士研究得出文心兰的大致适宜生长环境如下（段左俊等，2006)：生长适温18-25deg;C;最适光照强度为10000-25000LX; 而对基质的选择要求是透气和利水，常用基质材料有木屑、椰壳、树皮、木炭、水苔和厥根等，这些基质可单一或混合使用，其用量与肥料、栽培介质、品种、年龄等因子有关（Pooletal.，1982)，但比较明确的基质配比未见报道。文心兰很适应较高的空气湿度，其最适湿度为75%85%左右，6~7d绕一次透水，夏秋及干燥时节要每天加喷叶面水一次，冬季则可每2?3d喷一次叶面水，另外还要适当施肥，施肥宜少量多施，除低温天气，每2-3周施水溶性液体速效肥，花未开时施氮憐钾均衡复合肥，憐、钾肥是开花时应补充的。 . 2实验材料与所需仪器 2.1植物材料 本研究使用的实验材料为文心兰黄金2号（Oncidium Golden No,2、，为南茜的变异种。 2.2实验试剂 (1 )原核表达质粒;76/-2扮由中国热带农业科学院橡胶研究所育种课题组赠送。 (2)反转录试剂盒RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis kit,限制性内切酶 FastDigest BamHI 和 FasteDigest Sal I 均购自于 Thermo Fisher 公司。 (3)大肠杆菌菌株DH5a、BL21和测序用载体PMD?7igt;-rSiniplevector,DNAase(D2270A), TaKaRaTaq(DR001), LA Tag DNA Polymerase (RR002A)，Ex Tag DNA Polymerase (RROOIA)，T4 DNA Ligase(D2011 A), DL2000Maker(D501A)，DLlOOOOMaker (D500A)，3#39; -Full RACE Kit (D314)，5#39; -FullRACE Kit (D315 )，MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0 ( D823A )，蛋白质分子量标准（D530S)，MiniBEST Plasimid Purification Kit Ver.3.0 (9760)，SYBRPremixExTagII(DRR820A)均购于宝生物工程（大连）有限公司。 (4)丙稀酰胺，0-巯基乙醇，PVP(聚乙稀卩比略烧酮），CTAB(溴化-16-焼基三甲基铵)，NaCl, ACC (1-氨基环丙烧-1-幾酸），EDTA (乙二胺四乙酸），Tris (三轻甲基氨基甲烧），SDS(十二烧基磺酸钠)等生化试剂均购自于上海生物工程有限公司。乙醇、冰醋酸、三氯甲院等其他常用试剂均为分析纯。 2.3主要仪器设备 (1)高压灭菌锅HVE-50:日本HIRAYMA公司。 (2)T1 Thermocycler PCR 仪：德国 Biometra 公司。(3)恒温水浴锅HH-S:金坛电子有限公司。 (4)焚光-紫外分析仪、三恒电泳仪DYY-11B:北京六一仪器厂。 (5)高速冷冻离心机Centrifoge5810R、常温离心机Centrifiige 5415D、微量移液器：德国 Eppendorf公司。 (7)突光定量PCR 仪：CFX96TM Real-Time Syste