玉米逆境响应基因ZmGST23克隆及表达概述.docVIP

　　玉米逆境响应基因ZmGST23克隆及表达概述 Ⅰ文献综述 1植物抗氧化系统概述 植物在生长过程中经常受到外界环境影响，其中受非生物胁迫影响最大，据估计 50%以上粮食减产是由各种非生物胁迫导致的[4]。非生物胁迫会造成一系列形态、生理、生化以及分子水平的变化，从而影响作物生长及产量形成[5]。在分子及细胞水平上，非生物胁迫对植物造成危害的重要标志就是体内活性氧（Reactiveoxygen species，ROS）如单线态氧（1O2）、超氧阴离子（O2bull;-)、过氧化氢（H2O2）及羟自由基（OH ）的大量产生。ROS 在体内发挥着两种相对立的作用，少量的ROS作为信号分子可以激活植物体内的防御反应，但过量ROS会对细胞产生伤害，大量的 ROS 会造成脂质过氧化、蛋白氧化、核酸损伤、酶活受抑制，造成细胞程序性死亡（Programed cell death，PCD）甚至细胞死亡[6]。在植物抗氧化反应中，体内 ROS 水平及抗氧化能力之间的平衡决定植物细胞的命运(图 1-1)，正常环境下抗氧化防御系统只清除正常代谢产生的 ROS，ROS 水平与抗氧化能力基本保持平衡。一旦遭受胁迫，这个平衡就会被打破，抗氧化系统发挥作用来清除体内的 ROS。由于非生物胁迫对农业生产影响巨大，迫切要求育种学家选育出能应对多种环境胁迫的作物新品种。ROS 是细胞内有氧代谢的产物，主要存在于叶绿体、线粒体及过氧化物酶体中[7]，其中叶绿体是植物体内产生 ROS 的主要部位，在光合作用过程中容易产生1O2；在光合电子传递链中发生 Mehler 反应会产生 O2bull;-，它在 SOD 的催化下又会生成 H2O2，并且 ROS 产生的多少受高光强、干旱等环境因素的影响[8]。在叶绿体进行 CO2固定时，核酮糖 1,5-二磷酸加氧/羧化酶的加氧酶活性增强，产生的羟乙酸盐从叶绿体转运到过氧化物酶体中，在羟乙酸盐氧化反应、脂肪酸的beta;-氧化剂及脂质代谢等过程中都会伴随 H2O2的产生[9]。植物线粒体电子传递链也是细胞内产生 ROS 的主要，尽管线粒体中 ROS 远远小于叶绿体，但线粒体中的 ROS在调节包括胁迫适应及细胞程序性死亡在内的胞内加工过程中起着重要作用[10]。在乙醛酸循环体中，乙酰辅酶 A 氧化酶是 H2O2的主要；同时，结合于质膜上的 NADPH 氧化酶以及过氧化物酶是 O2bull;-和 H2O2产生的主要；另外，在细胞质和内质网上催化解毒反应的细胞色素也是产生 ROS 的[11]。 .. 2植物谷胱甘肽硫转移酶研究进展 1960年，研究人员发现GSTs在动物新陈代谢及机体脱毒过程中发挥重要重要作用[27，28]。1970年人们发现玉米GSTs能催化除草剂与还原型GSH结合从而护玉米免受除草剂的伤害[29]，至此，首个植物GSTs在玉米中被发现。此后，在动物、植物、真菌中相继检测到GSTs活性[28，30]。1980年，Timmerman从玉米中纯化并克隆出除草剂代谢相关的GSTs基因[31]之后，Droog将动物和植物的GSTs基因序列进行比对后发现，二者之间存在很大差异[32]。GSTs是超基因家族的产物，在长期进化过程中每一种异构酶都有其特异性结合的底物并且序列差异变化大，水稻GSTs家族成员间的基因序列一致性在40.0%以下，氨基酸序列同源性通常不超过20.0%[33]。1996年，Marrs首先提出将植物GSTs分为三类[26]，Droog、Edbda类GSTs，它们与之前四类GSTs亲缘关系很远，其活性位点上的Ser被Cys所取代，也是植物所特有的GSTs。 .. Ⅱ 材料与方法 1材料 1.1植物材料 玉米自交系 F83 种子由甘肃农业大学玉米育种课题组提供。 1.2菌种和质粒 大肠杆菌菌株为 E.coli DH5a，由本实验室保存。T-载体 PCR 产物克隆试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司，大肠杆菌 E.coli BL21（DE3）、原核表达载体 pEASY-E1 Expression Kit 购自北京全式金技术有限公司。 1.3工具酶、化学试剂及试剂盒 Trizol Reagent 购自于 Invitrogen 公司；DNaseⅠ购自 OMEGA 公司；限制性内切酶、DL2,000 DNA Marker、第一链 cDNA 合成试剂盒（PrimeScriptTMRT reagentKit eSTAR HS DNA Polymerase 和 TaKaRa ExTaqTM购自大连宝生物工程有限公司；通用型 DNA 纯化回收试剂盒（离心柱型，目录号：DP214）购自 TINAGEN 公司，氨苄青霉素（Amp）购自 Sigma 公司；平端 DNA 片段添 A 试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；Pro