肾透明细胞癌之ALK融合基因表达及功能研究.docVIP

　　肾透明细胞癌之ALK融合基因表达及功能研究 前 言 肾癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，其发病率仅次于膀胱癌[1]。目前，在全球肿瘤新病例中，肾癌发病率以平均每年 2.5% 的速度增长，占所有新发肿瘤的 2%～3%[2]。每年全球有 273,518 名肾癌新发病例，并有 116,368例患者因该病而死亡。而在中国，每年新发病例有 32,508 例，死于该病有10,675 例[3]。肾癌起源于肾实质中肾小管上皮细胞，又称肾细胞癌。肾细胞癌的病理类型多样，最常见病理类型是肾透明细胞癌，约占肾癌的 80%～85%[4]。近年来，影像学的发展给患者带来福音，使得多数肾癌患者在诊断时属于局限性肾癌，手术切除可以治愈大部分早期患者，预后较好，5 年生存率Ⅰ期65%～93%、Ⅱ期 47%～77%，但是仍有 20%～40%的患者手术后出现复发或者远处转移[5]。然而，近三分之一的患者在确诊时已出现远处转移。特别是转移性肾癌的预后相当差，5 年生存率不到 10%[5,6]。因此，临床上面临的一项重大挑战是晚期转移性肾癌的患者如何寻找新的诊断和治疗方法。随着肾癌发病分子机理阐明和报道，使得在分子水平上针对其发病机制研发新靶点药物成为可能，如抑癌基因 VHL 在 80%的肾透明细胞癌患者中存在失活，从而激活 mTOR 信号通路，诱导 VEGF 的表达。因此，针对此信号 通 路 的 分 子 靶 向 药 物 成 为 研 究 的 热 点 并 先 后 问 世 ： 贝 伐 单 抗（bevacizumab），舒尼替尼（sunitinib），索拉非尼（sorafenib），替西莫司（temsirolimus），依维莫司（everolimus），帕唑帕尼（pazopanib）和阿西替尼（axitinib）[7]，已经成为晚期转移性肾癌治疗的一二线药物，虽然在治疗上带来令人鼓舞的成绩，但是达到完全缓解无病生存的患者还是很少。 ALK 基因编码细胞膜受体蛋白，属于酪氨酸激酶受体家族。在生理状态下，配体与受体相结合后引起 ALK 二聚化，继而胞内酪氨酸残基磷酸化，活化下游信号通路[8]。在 ALCL 中首次发现 ALK 基因与 NPM 形成融合基因具有致癌活性[9]。后继研究在 IMT、NSCLC 和卵巢癌中发现有 ALK 异位形成新的融合基因[10,11,12]。在 NB 中也有 ALK 基因突变的报道[13]。此外，在炎性乳腺癌、食管癌、NB 中发现有 ALK 基因扩增[14,15,16]。PI3K/AKT、RAS/Raf/MEK/ERK 和 JAK/STAT3 等下游信号通路由于 ALK 基因突变、扩增或者形成新的融合基因异常激活，参与肿瘤的发生发展[17]。2007 年，日本学者 Soda 等首次报道在肺腺癌患者手术标本中发现EML4-ALK 融合基因。进一步研究将转染 EML4-ALK 融合基因的小鼠 3T3成纤维细胞接种到裸鼠体内成瘤[11]。其他学者报道 EML4-ALK 融合基因阳性的人体肺癌组织中 ALK 基因 mRNA 水平显著升高[18]。这些研究证实了EML4-ALK 融合基因具有致瘤作用，在 NSCLC 发生发展中起着至关重要的作用。因此，针对 ALK 的靶向治疗成为肿瘤治疗研究的热点。而在临床上已经报道多例 ALK 抑制剂用于 NSCLC、ACLC、IMT 的治疗[19,20]。克唑替尼（Crizotinib）是一种 ALK 抑制剂，Crizotinib 与 ATP 竞争性结合 ALK 激酶催化区域起到抑制 ALK 作用[21]。细胞学实验证实，Crizotinib对 ALCL、NSCLC 及 NB 等肿瘤中某些有 ALK 扩增或易位的细胞株具有抑制作用[22]。2011 年 8 月，由于 Crizotinib 在临床试验中取得良好的临床疗效，FDA 批准 Crizotinib 用于 NSCLC 的治疗[23]。目前研究表明，EML4-ALK 融合基因的发现和其抑制剂良好的治疗前景为肿瘤患者的靶向治疗开辟了新的道路[24]。 第一部分 ALK 融合基因在肾透明细胞癌中的表达 1.实验材料 收集 25 对和 62 对肾透明细胞癌及其对应的癌旁组织，分别来自解放军总医院和第二军医大学附属长海医院在 2011 年至 2013 年期间接受手术切除的肾透明细胞癌。所有标本均获取患者本人书面同意并且本研究通过中国人民解放军总医院和长海医院伦理委员会批准。标本收集严格遵守标本管理相关规定，标本离体后立即切成 3 小块，其中一块组织放入 10%福尔马林固定液中固定。另一小块放入 RNAlater 中，最后一块放入液氮罐中长期保存。患者临床病理资料见表 1.1。 1.2 实验试剂 (1) 10%福尔马林固定液（上海亿欣生物科技有限公司） (2) RNAla