棉花枯萎病菌拮抗菌的筛选及抑菌机理初探.pdfVIP

万方数据 The Researches on screening and mechanism of antagonistic bacteria in Cotton Fusarium wilt A Dissertation Submitted to Shihezi University In Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Natural Science By Cui Zheng-long (Microbiology) Dissertation Supervisor: Associate Professor Wang Ai-ying June, 2015 万方数据 万方数据 摘 要 目的：本研究从乌拉尔甘草、阿魏和苦豆子中筛选出拮抗棉花枯萎病菌的内生菌，初步分离拮 抗菌A 的抑菌物质，探究抑菌机理，并研究拮抗菌对棉花生长的影响。 方法：拮抗菌的分离和筛选采用平板培养法，生长曲线、最适pH 、糖发酵、淀粉水解试验及革 兰氏染色对拮抗菌的基本性质进行了研究；通过 16SrDNA 序列比对建立系统进化树。超声波破碎细 胞，离心分离胞内、胞外分泌物，硫酸铵沉淀透析法分离胞内抑菌粗蛋白，考马斯亮蓝G-250 法检 测蛋白浓度，Sephadex G-75 柱层析初步纯化抑菌蛋白，SDS法测定抑菌蛋白分子量大小。抑 菌物质对棉花枯萎病菌菌丝生长、产分生孢子和分生孢子萌发的影响分别采用平板培养法、显微计 数法、凹玻片培养法。检测了拮抗菌A 处理棉花种子后，其萌发率和成株率的变化，以及棉苗在不 同生长时期的POD 、PPO、PAL 活性。 结果：1、本研究从乌拉尔甘草、阿魏和苦豆子中分离并筛选得到了4 株对棉花枯萎病菌具有拮 抗性的内生菌，其中拮抗菌A 抑菌效果最好，初筛抑菌圈直径达26.96mm 。经过鉴定，拮抗菌A 、 B、C 、D 分别属于Bacillus amyloliquefaciens 、Bacillus tequilensis 、Bacillus sp. 、Klebsiella pneumoniae 。 2、拮抗菌 A 的胞内分泌物对棉花枯萎病菌菌丝生长、产分生孢子和分生分生孢子萌发的抑制 率均大于胞外分泌物。其中对棉花枯萎病菌产分生孢子的抑制效果最好，平均抑制率为40.14% ，对 数生长期的拮抗菌对产分生孢子的抑制率最大，为88.81%。 3、浓度为80%的硫酸铵沉淀出的蛋白对棉花枯萎病菌的抑制率最大(19.55%) 。分离的粗蛋白保 持抑菌活性的最高耐受温度为60℃，最高耐受pH 为8，最低耐受pH 为4 。 4、抑菌粗蛋白经过Sephadex G-75 柱层析分离，在200-400s 之间收集的洗脱液对棉花枯萎病菌 产分生孢子的抑制率达34.79%，均大于其对菌丝生长和分生孢子萌发的抑制率。初步分离得到的抑 菌蛋白分子量在25 kDa- 100 kDa 之间。 5、拮抗菌A 处理棉花种子后可提高其成株率。棉花苗期不同生长时期的POD 、PPO 、PAL 酶 活性测定结果表明，接种棉花枯萎病菌后，用拮抗菌A 处理过的棉花植株在播种40d 后PAL 酶活性 显著增加；此外，同一生长时期、不同处理的棉苗3 种酶活性均无显著差异。 结论：本研究从乌拉尔甘草、阿魏和苦豆子中分离并筛选得到了4 株对棉花枯萎病菌抑制作用 较好的内生菌，初步探究了拮抗菌A 的抑菌机理；拮抗菌A 抑菌物质产生于对数生长期，胞内分泌 物抑菌效果