抗体,胶乳基本偶联步骤.doc

免疫胶乳偶联试验方案一 试剂准备： MES缓冲液 500mM，pH5-6，4℃储存； EDAC 配置浓度为52μmol/mL（称取10mg EDAC，加入1mL去离子水）； NHS 配制浓度为50mg/mL水溶液； 蛋白质溶液 缓冲液稀释至浓度为1－10mg/mL。 二步偶联法： 1. 将配好的溶液按以下顺序滴加入离心管 ① 100μL 500mM MES 缓冲液； ② 加水稀释至1mL； ③ 200μL 5％微球； ④ 230uL NHS 溶液 ⑤ EDAC 水溶液（计算量） 2. 放置在恒温摇床上，37℃，120rpm，30min； 3. 13000rpm离心30min，沉降后，弃上清，收集离心沉淀；用1mL 50mM MES 缓冲液洗涤2次；离心沉降后，弃上清。 4. 将配好的溶液按以下顺序加入离心管中，混匀 ① 100ul 500mM MES 缓冲液； ② 加水稀释至1mL； ③ 蛋白质溶液。 5. 放置在恒温摇床上，37℃，120rpm，2h； 6. 13000rpm离心20min沉降后，弃上清，收集离心沉淀；用1mL 50mM MES 缓冲液（或者调节pH至8.0左右），同时加入BSA溶液至其终浓度为1%，洗涤3 次；离心沉降后，弃上清。 7. 加入0.97mL MES 缓冲液（或者调节pH至8.0左右），将微球浓度调为1％，并重新悬浮，然后搅拌，接着温和的超声分散； 8. 重新悬浮后加入一定量的BSA溶液（比如终浓度为1%） ，保存。 9．福林酚法测定偶联蛋白质含量（可选）。（如要测蛋白质含量，则前面的方法中不可加入 BSA。） 免疫胶乳偶联试验方法二 1. 每ml反应混合物加入以下成分： 加入DIW，定容最终体积为1ml； 0.1ml 10X的MES buffer，ph6.0~6.5（10X的buffer通常用0.5M）； 0.1ml 10%的微球(终浓度为1%)； 0.23ml NHS水溶液（50mg/mL）; 11.5mg 一定体积的19.2mg/ml(100mM)的EDAC水溶液； 2. 室温下搅拌反应15~30min；（Note7） 3. 清洗：MES buffer或DIW清洗 两次；（Note3）； 4. 用MES buffe或者DIW悬浮微球到浓度为1%； 5. 同时，用MES buffer溶解稀释抗体。buffer一般为ph7~9，50mM~100mM。最终的蛋白浓度1mg/mL; 6. 清洗完微球后，立即加入一定体积的抗体溶液。（Note 2）。（注意：此处给出的例子，微球浓度和蛋白浓度和buffer分别为0.5%（w/v），0.5mg/mL，25~50mM）; 7. 室温下搅拌孵育2hr； 8. 每ml反应液中加入2.5ml 乙醇胺，室温搅拌孵育10~30min； 9. 清洗：MES buffer清洗两次离心去除上清，重新悬浮微球，然后 搅拌，接着温和的超声分散（加入一定量的BSA）。（Note 3/4） 免疫胶乳偶联试验方法三 取0.1ml胶乳微球，加入0.9ml,0.1mol/L,PH6.0的MES混合。 向上述混合液中加入 取40ul待偶联抗体(10mg/ml)加入到1ml经过活化的胶乳微球溶液中，室温下温和搅拌4h，10000r/min离心15min，沉淀用含0.05%Tween20的PBS重复清洗3次，然后用0.1mol/LPBS复溶，即得到胶乳-抗体蛋白复合物溶液。