微生物遗传育种综合试验.docVIP

微 生 物 遗 传 育 种 实 验 姓名： @@ 学号：122@@@@@ 专业：生物制药 微生物遗传育种实验 一 、【实验目的】 1. 明确培养基的配制原理。是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。它含有酵母提取物、蛋白胨和NaCl。其中酵母提取物为微生物提供碳源和能源，磷酸盐、蛋白胨主要提供氮源，而NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂。琼脂在常用浓度下96时溶化，一般实际应用时在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在40时凝固，通常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。由于这种培养基多用于培养细菌，因此，要用稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。 试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸汽灭菌锅，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。 将取出的菌种于37℃恒温箱，培养12h，即可使用。（注：要将原始菌种放回冰箱） 牛肉膏蛋白胨培养基的制备 实验前准备工作：超净工作台提前预热30min，用牛皮纸包好的培养皿(d=9cm和d=6cm)、转子、装有9ml和10ml自来水的试管、装有100ml自来水的锥形瓶等玻璃仪器于121.5高压蒸汽灭菌锅内进行灭菌30min。取出，将转子和培养皿放入烘箱中烘干，备用。 配方：牛肉膏1.5g，蛋白胨5g，氯化钠2.5g,琼脂8g,水500ml，pH值7.4~7.6 称量按培养基配方比例依次准确地称取酵母提取物、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错。 溶化：用天平称量所需药品于1000ml大烧杯中，加适量水用玻璃棒搅拌至溶解，然后加入琼脂，待药品完全溶解后，用自来水补充至所需的总体积。 分装：按实验要求，可将配制的培养基分装于500ml的锥形瓶中，分别装300ml和20ml。分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。加塞培养基分装完毕后，在锥形瓶瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。 包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。 灭菌：将锥形瓶放入121.5待压力表降至0时，打开高压蒸汽灭菌锅将培养基取出。无菌检查将灭菌的培养基放入37的温室中培养24～48小时，以检查灭菌是否彻底 倒平板：将准备好的培养皿、培养基放入超净工作台中。倒平板之前需要对手进行灭菌，用酒精棉球擦拭即可（注：尤其是手指部位，在操作过程中不能把手从隔挡玻璃里拿出，以免染菌而影响实验结果，倒平板时要一直在酒精灯附近进行）。倒6个平板（d=9cm)，待凝固后，放入恒温培养箱中培养12h，备用。 3. 紫外线诱变 实验前准备工作：预热紫外灯30min，功率15W，照射距离30cm。准备好的平板、试管、试管架、接种环、移液枪、枪头和涂布棒等放进超净工作台中。 梯度稀释：在超净工作台中，用灼烧后的接种环挑取一环原始菌种于10ml的试管中，摇匀，作为原样（注：要将原始菌株从超净工作台中取出，以防突变）。用移液枪取1ml原样于9ml试管中，进行10倍稀释，稀释成10-1样品液，然后从10-1的样品液吸取1ml于另一支试管，稀释成10-2样品液（注：每次的吸取都要换枪头），依次类推，稀释成10-3,10-4的样品液（注：各管都需要用移液枪吹打几次，混匀）。 诱变前的工作： 照射：紫外线照射的时间分别为5s、10s、30s。将装有3ml样品液的培养皿的皿盖打开计时，当照射达5s时立即盖上皿盖，再关闭紫外灯。然后用移液枪分别吸取0.2ml照射的样品液分别放到平板上（d=9cm），用涂布棒涂布均匀（注：涂布棒需蘸取少量酒精，然后灼烧一下，等温度达到适宜时在进行涂布）。涂布好的平板需要用黑塑料袋包好，贴上标签，在标签上注明日期，照射时间及实验小组。接着用紫外灯再照射5s，打开皿盖计时，到达5s时，立即盖上皿盖，关闭紫外灯。重复以上的工作。接着用紫外灯再照射20s，打开皿盖计时，到达20s时立即盖上皿盖，关闭紫外灯。重复以上的工作。将6个平板（d=9cm)放于37。 4.双层平板法证明抗药性 实验前准备工作：预热紫外灯30min，从恒温培