质粒dna的分离与纯化tword文档.docVIP

质粒DNA的分离与纯化 吴乃虎 （中国科学院遗传与发育研究所） 黄美娟 （北京大学生命科学学院细胞遗传学系） 一. 导言 1. 质粒DNA的分离 应用质粒作为基因克隆的载体，—个重要的条件是要获得批量的纯化的质粒DNA 制剂。通常所说的质粒DNA的制备，事实上包括质粒DNA的分离和质粒DNA纯化 两个步骤或两个内容。 ⑴ 质粒DNA的分离 这是指应用溶菌酶或是十二烷硫酸钠(SDS)处理大肠杆菌寄主细胞，使之完 全裂解，释放出完整的染色体DNA及质粒DNA。 在这个步骤，要求操作十分温和而小心谨慎，要尽量避免染色体DNA发生断裂。大肠杆菌细胞裂解液经离心之后，获得了含有大量质粒DNA的上清液。 ⑵ 质粒DNA的纯化 在离心所得的大肠杆菌细胞裂解液上清液中，不可避免地含有寄主细胞染色体DNA 短片段，因此需要设法除去这些污染的DNA片段，使质粒DNA得以纯化出来。 2. 选择制备质粒DNA技术程序必须考虑的因素 己经发展出了许多种用于制备质粒DNA的快速简易的方法。针对不同的具体实验 的对 象，究竟应选择何种技术程序，主要应考虑如下这些因素： 所研究的目的质粒DNA分子量的大小； 实验程序要尽可能简单，並有良好的重复性； 要使用溶菌酶溶菌的细菌种属，以及 溶菌酶以外的其它溶菌药剂； 实验方法要温和，如果是制备大分子量的质粒DNA，这点尤其要重视； 质粒DNA的产量(这点与质粒拷贝数密切相关)； 提取质粒DNA的实验用途，例如供作限制酶酶切分析，或是进行转化 实验等。 3. RNA及蛋白质等污染物的去除 对于—般的转化实验以及克隆过程，并不—定需要制备纯化的质粒DNA。但是为了构 建限制性酶切图谱，为了获得发表用的图片，以及—些特定的克隆程序等，则需要制 备纯化的货粒DNA。为此需要在质粒DNA纯化过程中加RNase处理以除去RNA，用酚 抽取除去蛋白质，或是加入核酸酶抑制剂：焦碳酸二乙酯，以除去—些菌种中存在 内源核酸酶。 二. 微量碱法制备质粒DNA 1. 溶液配制 （1）Solution 1[ 50mM Glucose,25mM Tris-HCl(pH 8.0),10mM EDTA] Glucose 991.0mg 2M Tris-HCl(pH 8.0) 1.25ml 0.5M EDTA (pH 8.0) 2.0ml Lysozyme 4mg/ml G.D.H2o --------( 100 Autoclaved for 15 mins at 10 b/in2 and stored at 40C。 Pawdered lysozyme shold be dissolved in the solution just before use。 50mM， Glucose 有利于pH值的调节。 Solution 1成份中的Tris 和EDTA，实质上就是TE buffer 的成份。 因为把细胞DNA释放(悬浮)在TE 缓冲液中要比直接处理获得更佳的 溶菌效果。 e. EDTA是二价金属离子(例如Mg卄)的螯合剂，故可抑制核酸酶对DNA分子 的降解作用。 f. TE buffer：[10mM Tris-HCl(pH 8.0),1m MEDTA(pH 8.0)]在10b/in2的 条件下，消毒15分钟待用。 （2） Solution 2 [0.2N NaOH, 1.0%SDS] (pH 12.0-12.45) 10N NaOH 2 ml 20% SDS 5 ml G.D. H