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第四章 灭菌与除菌（二）广药生科院周林 内容 一、无菌检查的方法 二、染菌的处理 三、制服染菌的要点 习题 一、无菌检查的方法 肉汤培养法 显微镜检查法(镜检法) 平板划线培养或斜面培养检查法 肉汤培养法 组成：0.3％牛肉膏、0.5％葡萄糖、0.5％氯化钠、0.8％蛋白胨、0.4％的酚红溶液(pH7.2，呈红色)的酚红肉汤作为培养基。 方法：将待检样品直接接入经完全灭菌后的该肉汤培养基中，分别于37 ℃、27 ℃进行培养，每6 h观察一次微生物的生长情况，并取样进行镜检，该肉汤培养基由红色变为黄色或产生浑浊，即判断为染菌。肉汤培养法常用于检查培养基和无菌空气是否带菌，也可用于噬菌体的检查。 显微镜检查法(镜检法) 用革兰氏染色法(Grams stain)对样品进行涂片、染色，然后在显微镜下观察微生物的形态特征，根据生产菌与杂菌的特征进行区别、判断是否染菌。 检查杂菌最简单、最直接，也是最常用的检查方法之一。 平板划线培养 将待检样品在无菌平板或斜面上划线，分别于37 ℃、27 ℃进行培养，一般24 h后即可进行镜检观察，检查是否有杂菌。有时为了提高平板培养法的灵敏度，也可以将需要检查的样品先置于37 ℃条件下培养6 h，使杂菌迅速增殖后再划线培养。 二、染菌的处理 2.1 染菌的原因（3个表格） 从染菌的时间：发酵前、中、后期 从染菌的规模：大批量发酵罐染菌、部分发酵罐染菌、个别发酵 罐连续染菌 （多选题） 从染菌的类型 四环素的发酵过程最怕污染双球菌、芽孢杆菌和夹膜杆菌； 柠檬酸的发酵最怕青霉菌的污染； 谷氨酸发酵最怕噬菌体污染。 染菌的原因 表2 某厂链霉素发酵染菌原因分析 表3 上海天厨味精厂谷氨酸发酵染菌分析 2.2 染菌的处理（五点） 一、种子带菌及其防治 1）严格控制无菌室的污染 2）在制备种子时对沙土管、斜面、三角瓶及摇瓶均严格进行管理 3）对每一级种子的培养物均应进行严格的无菌检查 4）对菌种培养基或器具进行严格的灭菌处理 二、空气带菌及其防治 空气的净化工艺和设备的设计 过滤介质的选用和装填 过滤介质的灭菌和管理等 三、操作失误导致染菌及其防治 而淀粉质原料，在升温过快或混合不均匀时容易结块，使团块中心部位“夹生” 。 灭菌时由于操作不合理，未将罐内的空气完全排除，造成压力表显示“假压”，使罐内温度与压力表指示的不对应。 泡沫染菌。 移种时或发酵过程罐内压力跌零。 四、设备渗漏或“死角”造成的染菌及其防治 五、噬菌体污染及其防治噬菌体档案 噬菌体是一类病毒，原指细菌病毒，近年来发现真菌、藻类都有噬菌体。 噬菌体体积微小，只有在电子显微镜下才能看见。 是一种非细胞结构的生命，但只有进入宿主细胞才具有生命特征，并具有寄主专一性。 在遗传上研究得较清楚的是大肠杆菌的T系噬菌体。 污染噬菌体的处理 ⑴ 并罐法 ⑵ 轮换使用菌种或使用抗性菌株 ⑶ 放罐重消法 ⑷ 罐内灭噬菌体法 当噬菌体污染情况严重，上述方法无法解决时，应调换菌种，或停产全面消毒，待空间和环境噬菌体密度下降后，再恢复生产。 文献阅读 制服染菌的要点 染菌的原因（回顾） 制服染菌的要点 人＋物 1 操作人员 2 对空气净化系统的要求 洁净度 3 对蒸汽的要求 蒸汽的质量（稳定、活蒸汽) 4 对无菌室的要求 万级 5 对工艺操作的要求 工艺规程 作业 无菌检查的方法有哪些？ 染菌的主要原因及处理方式？ 制服染菌的要点有哪些？ * * 表一 日本工业技术院发酵研究所1965年对抗生素的发酵染菌原因分析 2.2 染菌的处理 2.2 染菌的处理 2.2 染菌的处理 2.2 染菌的处理 百级无尘车间，千级净化室，万级洁净室