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体外组织工程软骨构建及其对关节软骨损伤修复【摘要】 目的 探讨体外组织工程软骨的构建及其对关节软骨损伤治疗的可行性。方法 ①体外分离、培养、扩增骨髓基质干细胞，诱导分化培养为软骨样细胞；②以胶原膜为支架在体外构建组织工程软骨；③建立兔髋关节软骨缺损动物模型16只，对照组8只，实验组8只；应用组织工程软骨修复兔股骨头关节软骨缺损，8、16周后观察修复效果。结果 8周后大体标本显示关节软骨缺损为白色软骨样组织填充，组织切片显示缺损处有新生软骨形成，阿新兰染色和Ⅱ型胶原免疫组化检测有GAG和Ⅱ型胶原强阳性表达；16周后关节软骨缺损仍为软骨样组织修复，部分见表面粗糙，镜下见软骨细胞排列紊乱。结论 体外构建的组织工程软骨可用于修复兔股骨头关节软骨缺损，较长期的观察结果显示有退变倾向。 【关键词】骨髓基质干细胞；髋关节；软骨缺损；组织工程 关节软骨损伤修复是骨科学研究的热点，组织工程技术的出现为关节软骨损伤的治疗提供新思路。目前常用的研究方法为在体外培养扩增种子细胞，在体外与生物材料结合后直接植入体内修复关节软骨缺损[1]。我们通过组织工程技术在体外构建组织工程软骨，并应用于修复兔股骨头关节软骨损伤，现报告如下。 1 材料与方法 1．1 实验动物 3月龄健康新西兰大白兔16只，雌雄对半，体质量2．1～3．4 kg，购自上海中科院实验动物中心。 1．2 主要实验仪器和试剂 CO2培养箱（HERA），超净工作台（苏州净化设备厂），倒置显微镜（Olympus），DMEM培养液、0．25%胰蛋白酶、细胞因子TGF-β、b-FGF（Sigma），小牛血清（杭州四季青生物公司），Ⅱ型胶原免疫组化试剂盒（北京中杉生物公司），RNA提取试剂盒（QIA），RT-PCR试剂盒（晶美生物公司），组织细胞染色（本院病理科提供），生物材料胶原膜由中科院生物医学工程研究院提供。 1．3 实验方法 1．3．1 骨髓基质干细胞的获取 可取自两侧髂棘，用16号骨髓穿刺针抽取骨髓2 ml，针筒内预先置入1 ml DMEM培养液（含肝素1 000 U），以3∶7的比例加入淋巴细胞分离液，以2 000 r/min，15 min离心，吸取中间单个核细胞层，再用DMEM培养液冲洗3次，血球计数板计数。 1．3．2 骨髓基质干细胞培养 按15×10?5/ml细胞浓度培养，培养液DMEM培养基含小牛血清12%、青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml，培养条件为5%CO2、37℃、饱和湿度，培养3 d后更换所有培养液，以后隔天换液1次至细胞单层融合，应用0．25%胰酶消化获得第一代骨髓基质干细胞用于诱导分化实验。 1．3．3 骨髓基质干细胞诱导分化 取上述细胞，加入含25 ng/ml TGF-β、2 ng/ml b-FGF和12%小牛血清的DMEM诱导分化培养液，2 d换液1次，7 d传代1次，获取第3代细胞作为本研究实验细胞。 1．3．4 体外组织工程化软骨的构建 取上述细胞悬液进行浓缩，密度为2．5×10?7/ml，滴注到胶原膜上，4 h后缓慢加入诱导分化培养液，3 d半量换液1次，维持培养2周后用于检测及体内实验。 1．3．5 体外构建组织工程软骨特性检测 取上述构建的组织工程软骨福尔马林固定、石腊包埋、切片，HE染色，阿新兰染色，RT-PCR进行Ⅱ型胶原基因表达检测。 1．3．6 股骨头关节软骨缺损模型制作与组织工程修复 1%戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉，常规消毒铺巾，取兔髋关节外侧纵形切口，切开髋关节外侧肌群，暴露髋关节关节囊，“T”切开关节囊，手法致髋关节脱位，暴露股骨头，用环钻人为造成股骨头负重区直径约3 mm、深约3 mm关节软骨缺损，取上述构建的组织工程软骨，交替植入一侧软骨缺损区为实验组，相应的另一侧不作任何处理为空白对照组或单纯用胶原膜修复为材料（实验组16个缺损，空白对照8个缺损，材料对照8个缺损）。手法复位，认真缝合髋关节关节囊及各层组织，术后让动物自由活动，于8、16周后处死动物，取髋关节软骨缺损修复情况。 1．3．7 组织学检查 取修复组织福尔马林固定后，脱钙后石腊包埋、切片、HE染色，Ⅱ型胶原免疫组化染色，观察修复结果。 2 结果 2．1 骨髓基质干细胞分离与培养 分离的细胞在培养第2天开始出现细胞贴壁生长，呈纺缍形、多角形、短梭形，细胞增殖旺盛，8 d后长满培养瓶，在倒置显微镜下细胞形态一致。 2．2 组织工程化软骨的特性 经诱导分化培养2周后胶原膜与细胞复合体体积变化不明显，质地仍较软。HE染色显示复合体内细胞呈梭形，未见明显软骨陷窝，RT-PCR可检测出Ⅱ型胶原基因有较强的阳性表达，阿新兰染色显示细胞周围基质强阳性着色。 2．3 大体标本 术