国产MH琼脂质量控制探析.docVIP

国产MH琼脂质量控制探析MH琼脂(Muller Hinton Agar)是至今被国际公认和WHO推荐的最适用于琼脂纸片扩散法(Kirby―Baner纸片扩散法)测定细菌对抗生素敏感性的培养基。究其原因，主要由于MH琼脂培养基产品批间药物敏感试验重复性比其他培养基好；接种于MH琼脂培养基上，绝大多数致病菌生长良好；MH琼脂培养基对磺胺、甲氧苄胺嘧啶、四环素的抑制成分含量低。国内外有关药物敏感试验的大量数据是由MH琼脂作为培养基试验得出的［1,2］。?? 1国产MH琼脂培养基作为药敏试验培养基使用存在的主要问题? 1.1批间产品的稳定性? 国产MH琼脂培养基批间产品稳定性不够，主要是MH琼脂中主要原料的质量不稳定性造成的：①酸水解酪蛋白(Casein Hydrolysate)，水解工艺的不稳定性。②牛肉浸出粉（Beef，Dehydrated infusion From），混有经酶消化的牛肉膏粉。③琼脂,去除游离的矿物质,才能保证药敏试验的结果。琼脂的凝胶强度及在培养基中的浓度均能影响药物的扩散［3,4］。④培养基碱性增加能扩大氨基糖苷类药物的抑菌圈。酸性增加能扩大四环素的抑菌圈。MH琼脂一般pH为7.2~7.4［2,5］，接近人体体液的pH值。? 1.2拮抗物质? MH琼脂原料中存在过量的被测药物的拮抗物质：① 胸腺嘧啶核苷（Thymidine） 胸腺嘧啶（Thymine）抑制磺胺类药和甲氧苄胺嘧啶的活力。胸腺嘧啶核苷对TMP的抑制是胸腺嘧啶的10倍。② MH琼脂中胸腺嘧啶和胸腺嘧啶核苷水平是否足够低，是否在合格范围内，美国国立临床实验室标准委员会（NCCLS）规定可用TMP-SMZ纸片鉴定，它对粪肠球菌 ATCC 29212的抑菌圈直径应≥20 mm，且边缘清晰［2］，这是检测MH琼脂是否合格的标准之一（表1）。 2007年上海市疾控中心培养基室用3株标准菌株在不同批次自配MH琼脂上对TMP-SMZ进行了抑菌圈测试，结果见表2。自配MH琼脂对粪肠球菌ATCC29212的平均抑菌圈为20.5mm, 表明原料中胸腺嘧啶和胸腺嘧啶核苷的含量是基本合格的。3株标准菌株抑菌圈的变异系数（CV）均小于5%，表明国产自配MH琼脂的稳定性还是可以的。? 1.3二价离子? Mg2+、Ca2+在培养基中的浓度变化，影响四环素、多粘菌素、氨基糖苷类药物的抗菌活性［2］。含量过高，使抑菌圈变小；含量过低，使抑菌圈变大。特别对铜绿假单胞菌的敏感性影响较大。一般认为,1000 mL培养基中Ca2+50~200 mg，Mg2+20～35mg较为适宜。Cu2+、Zn2+、Sn2+在培养基中只要微量存在，青霉素就会很快分解成青霉素噻唑酸而失去抗菌活性［2 ］。SO42-，琼脂中极易残存此离子，其可与多粘菌素、新霉素等药物发生化学反应，从而影响药物的扩散和抗菌活性［6］。 1.4其他? 氨基甲酸乙脂（Urethane）、叶酸、葡萄糖、某些蛋白胨和氨基酸对磺胺类药均有不等的拮抗作用。? 2干扰MH琼脂质量的外界因素? 2.1药敏纸片? 标准纸片直径(Ф)为1/4?(约6.35mm)，重量为（30±4）mg/cm2，吸水性为重量的2.5～3.0倍，pH=7.0，无影响抗菌活性的二价离子。抗生素含量必须符合NCCLS规定的浓度。长期保存应置于－20℃以下低温冰箱。使用前应将使用量纸片置0℃预温［2,8 ］。? 2.2细菌接种量? 细菌接种量是控制试验重复性的主要因素。一般接种量是0.5麦氏单位的菌液约0.1 mL。加大菌量可使抑菌圈缩小，反之能使抑菌圈扩大［5］。? 2.3平皿制备与保存? 9.0 cm平皿倾注培养基一般为25～30 mL，15 cm平皿为60 mL，厚度均应达4 mm。如大量配制应对产品抽样，于30～35℃，24 h作无菌试验培养。平皿应置于密封塑料袋内放入冰箱，2～7℃保存。有效期为7 d［7］。 2.4培养温度和时间? 最佳培养温度为35℃，培养时间为16～18 h。温度偏低细菌所需生长时间延长，造成抑菌圈变大；温度超过35℃，可使某些抗生素如：苯唑青霉素、甲氧苯青霉素等失效。有学者发现，在35℃培养时，对甲氧苯青霉素耐药的金黄色葡萄球菌在37℃时可不显示耐药［7］。?? 3推荐的MH琼脂质控方法? 3.1培养基制备? 按干粉培养基说明，正确称量和加蒸馏水或去离子水。煮沸溶解后，置121℃ 15 min灭菌。冷至55℃左右，倾注无菌平皿。9 cm平皿约25~30 mL，达到厚度4 mm。MH琼脂最终 pH在25℃应为7.2~7.4［2,5，7］。? 3.2常用质控菌株? 粪肠球菌 ATCC 29212；大