应用背向散射积分技术评价糖尿病大鼠心肌纤维化.docVIP

应用背向散射积分技术评价糖尿病大鼠心肌纤维化[摘要]目的 检测不同病程糖尿病模型大鼠的心肌背向散射积分(IBS),同时观察纤维化指标,探讨IBS与心肌纤维化的关系。方法 腹腔注射链尿佐菌素(65 mg#8226;kg-1)建立SD大鼠糖尿病模型,于第4、12、24周测定常规心功能参数(LVEF)、左室后壁校正IBS值(IBS%)、IBS周期性变异幅度(CVIB)。同期检测心肌纤维化指标:心肌羟脯氨酸含量(HPC),Masson染色观察胶原纤维容积分数(CVF)及血管周围胶原面积(PVCA),用免疫组织化学法对心肌胶原蛋白在心肌的分布及表达进行半定量分析,光镜与透射电镜对心肌行组织学观察,并与同龄正常大鼠进行比较。结果 (1)与对照组比较,糖尿病组的IB%明显增高(P0.05),第24周时明显降低(P0.05);糖尿病组心肌纤维化指标HPC、CVF、PVCA、胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ的表达均明显增高(P0.05).Compared with the control group,HPC,collagen volume fraction(CVF),perivascular collagen area(PVCA),and the expression of the type Ⅰ and Ⅲ collagen in heart were increased in diabetic rats(P 1 材料与方法? 1.1 糖尿病大鼠模型的制备及分组? 8周龄SPF级健康雄性SD大鼠50只(购自北京维通利华实验动物中心),体重180～210 g,平均(199.64±11.04) g。抽签法随机选取32只按65 mg#8226;kg-1腹腔注射链尿佐菌素(streptozotocin,STZ,Sigma公司)。注射后3 d及?7 d,断尾法用ACTIVE血糖仪(上海罗氏医药公司)测血糖,将血糖稳定大于16.7 mmol#8226;L-1、尿糖持续阳性者定为糖尿病大鼠模型(DM组)。除去未成模4只及死于急性并发症大鼠10只,余下的18只随机分为4、12、24周组,每组6只,同时随机选取同周龄大鼠各6只作为正常对照(CN)组。? 1.2 超声检测? 大鼠腹腔注射10%水合氯醛(350 mg#8226;kg-1)麻醉后取左侧卧位,应用HP-SONOS-5500超声诊断仪,S8探头,于M型超声下检测左心室波群并测量大鼠左室舒张内径(Dd)、收缩末期内径(Ds),计算左室射血分数(LVEF)。启动声学密度(AD)定量系统,调节深度(?2～3 cm)、总增益、时间补偿增益及侧方增益补偿,获得满意的左室长轴及乳头肌水平左室短轴切面,将连续2.48 s内62帧图像存入磁光盘。感兴趣区(ROI)置于左室后壁中间段的心肌层及心腔内,随心动周期运动。测得以下参数:峰-峰强度(PPI,即背向散射积分周期变化值,CVIB),平均图像强度(AII,即IBS),图像背向散射标准差(SDI)。心肌校正IBS(IBS%)=心肌层IBS值/心腔血流IBS值。? 1.3 标本采集? 腹主动脉放血处死动物,立即取左室心尖部1 mm×1 mm×2 mm左右心肌组织2块,放入2.5%戊二醛中,保存于4 ℃冰箱,用于电镜观察。将心脏自心尖部至心底部横断为3份,取中间段放入10%中性福尔马林中固定,做好标记,用于组织形态学观察(Masson三色染色、免疫组织化学染色),另2份放入做好标记的冻存管中,并立即投入液氮中,然后转移至-70 ℃冰箱,用于心肌羟脯氨酸(HPC)检测。? 1.4 心肌HPC浓度测定? 试剂盒购自南京建成生物技术公司。碱水解法进行前处理,用722可见分光光度计测550 nm处各管吸光度值,计算HPC。? 1.5 Masson三色染色法进行胶原染色? 应用Masson三色染色法对心肌进行染色(试剂盒购自福州迈新生物技术公司),胶原纤维呈蓝色,心肌细胞呈红色。用图像采集系统(Olympus公司)采图,Motic Med数码医学图像分析系统计算心肌胶原容积分数(CVF)和血管周围胶原面积(PVCA)。CVF=胶原面积/总面积,其中胶原面积不包括血管周围胶原面积;PVCA=壁内小动脉管腔周围胶原面积/该小动脉管腔面积。每组取12张切片,每张切片随机取5～?10个200倍显微视野图像。 1.6 免疫组化染色测定胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ的表达? 石蜡切片,TGF-β1采用柠檬酸高压抗原修复,胶原蛋白Ⅰ和胶原蛋白Ⅲ采用复合消化液酶修复,分别滴加抗兔胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ(武汉博士德生物制品公司)稀释一抗(1∶100),放入4 ℃冰箱过夜。再滴加生物素化山羊抗兔IgG和试剂SABC,DAB显色。每组取12张切片