血小板源性生长因子受体-β在蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛中作用.docVIP

血小板源性生长因子受体-β在蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛中作用【摘要】 目的 观察兔蛛网膜下腔出血（SAH）后基底动脉的血小板源性生长因子受体-β（PDGFR-β）的表达变化规律，从侧面反映血小板源性生长因子（PDGF）-BB在SAH后脑血管痉挛（CVS）的作用。方法 采用枕大池二次注血法建立稳定的兔CVS模型，应用HE染色、透射电镜、免疫组化技术等方法，观察兔基底动脉的超微结构变化及PDGFR-β的表达时间窗，并通过测量管径的变化来判断CVS的严重程度。结果 电镜结果提示SAH组的基底动脉部分内皮细胞脱落，紧密联接打开，内皮间隙扩大；内弹力膜扭曲、断裂；平滑肌细胞胞浆空泡状，排列紊乱；外膜可见大量中性粒细胞、单核细胞浸润；管腔狭窄呈急性期收缩和迟发性痉挛双相改变；免疫组化结果提示对照组的PDGFR-β无阳性表达，SAH组的PDGFR-β表达升高,在第5、7天时最为明显（P 1 资料与方法 1.1 动物及其分组 健康清洁的新西兰大白兔36只（上海生旺实验动物养殖有限公司提供） 许可证号SCXK（沪）2007-0007，质量2.0～2.8 kg，雌雄不限。其中制模导致死亡9只，重新补入实验动物9只后，随机分为2组：①对照组：6只。②SAH组：30只。SAH组根据注血后处死时间，随机分为注血后1、3、5、7、10 d，共5组，每组6只。 1.2 CVS模型的制备 采用枕大池二次注血法建立稳定的兔CVS模型。 以盐酸氯氨酮（30 mg/kg）和盐酸氯丙嗪（7.5 mg/kg）联合行肌内注射麻醉，侧卧位枕部常规消毒后，充分暴露寰枕关节间硬脊膜，用2 ml注射器针头行枕大池穿刺，缓慢释放脑脊液0.4 ml/kg，同时将未抗凝的等量兔自体耳中央动脉血，缓慢注入枕大池，术后保持头低位30 min。对照组用等量的37℃生理盐水代替动脉血，余处理同上。48 h重复上述操作，注入的动脉血量为0.2 ml/kg。二次注血后24 h为SAH后第1天，依次类推。 1.3 标本留取方法 将SAH组按照不同时间点、对照组于造模后第5天过量麻醉，充分暴露心脏和主动脉根部，夹闭下腔静脉和降主动脉，左心室穿入自制灌注针头，同时剪开右心房放血，用多聚甲醛溶液经心脏灌注固定后，开颅取含基底动脉的脑干，置入多聚甲醛固定24 h后，进行组织取材、石蜡包埋、组织切片（与血管横断面平行，层厚4 μm）。 1.4 基底动脉直径测量 每个标本分别切1张切片，行常规苏木精-伊红染色，并通过计算机图像分析系统（Image-pro plus5.1），量化分析对照组和SAH各组基底动脉管腔直径变化。 1.5 透射电子显微镜观察 另取新西兰大白兔4只，将其随机分为2组：①对照组（NS组）：2只。②SAH组术后第7天：2只。制模及取材过程大致同上，灌注时采用的是预冷的2.5%戊二醛溶液。具体过程：3%戊二醛-1.5%多聚甲醛前固定，1%锇酸-1.5%亚铁氰化钾后固定，酒精-丙酮脱水，环氧树脂618包埋剂包埋；超薄切片，醋酸铀、柠檬酸铅染色，飞利浦208型透射电镜观察、摄影。 1.6 PDGFR-β表达的检测及结果判断 一抗：兔抗兔PDGFR-β多克隆抗体，SANTA CRUZ公司；二抗：PV9002，北京中杉金桥生物工程公司。一抗浓度按1:200稀释，并严格按照兔超敏二步法试剂盒说明进行免疫组化染色。PBS代替一抗作为阴性对照，乳腺癌组织作为阳性对照。采用Leica DM2500显微镜拍照系统（福建医科大学实验室提供）分别对各组标本基底动脉内皮细胞和平滑肌细胞的PDGFR-β的表达进行观察，免疫组化染色后细胞质中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，每个标本分别取3张切片进行免疫组化。 1.7 统计学方法 采用SPSS 11.5统计软件进行数据处理，各组基底动脉直径的均数采用单因素方差分析（One-way，AVONA，LSD检验），PDGFR-β的表达情况采用Mann-Whitney U检验，P0.05），其余组间比较，直径变化比较差异有统计学意义（P 本实验通过兔枕大池二次注血法建立兔CVS模型，结果提示兔CVS模型的血管痉挛现双相期改变，急性脑血管收缩出现在第1天，随后逐渐缓解，而迟发性CVS在第3天左右出现，在第7天达到高峰后逐渐缓解，与临床上SAH患者出现CVS的时相基本一致。同时，透射电镜示SAH组的基底动脉出现相应的超微结构变化，这均表明实验模型的制作是成功的。本实验应用免疫组化技术观察PDGFR-β在SAH后血管壁的表达情况，发现在正常对照组的血管壁上无阳性细胞表达，在SAH后第1天开始出现少量阳性细胞，第3天逐渐增多，在第5、7天达到高峰后，第10天逐渐下降，表达部位主要在血管内皮细胞上，平滑肌和外膜亦