LC-MS-MS法分析人体内25-羟基维生素D2及25-羟基维生素D3浓度系统综述.doc

LC-MS/MS法分析人体内25-羟基维生素D2及25-羟基维生素D3浓度系统综述摘要人体系统循环中的25-羟基维生素D2（25(OH)D2）和25-羟基维生素D3（25(OH)D3）浓度反映着人体内的维生素D状态。本综述旨在对使用LC-MS/MS法分析人体内25(OH)D浓度的方法进行全面的综述和评价。通过搜索数据库共筛选到20篇相关文献，发现同位素内标的选择、质谱离子源、衍生化、母离子的选择、基质效应和干扰物分离等因素会影响分析的准确度和灵敏度。为了建立一个灵敏和准确的分析方法，需要对上述影响因素进行优化。 关键词25-羟基维生素D2 25-羟基维生素D3 LC-MS/MS法 同位素内标 基质效应 中图分类号：O657；Q565 文献标识码：A 文章编号：1006-1533(2011)10-0477-04 1维生素D的生理效应及体内特点 维生素D是一个脂溶性维生素，在维持人体内钙的动态平衡方面起着非常重要的作用，能和钙一起促进儿童骨骼的形成和维持成人骨骼的强度。在儿童中，维生素D的缺乏会导致骨骼畸形，如出现佝偻病等；而在成人中，维生素D的缺乏会导致骨质疏松症[1]。最近有研究证实，血清中维生素D浓度高与较低的乳腺癌、结肠癌和前列腺癌的发生率有显著的相关性[2]。维生素D缺乏也可能是一个潜在的心血管疾病危险因素[3]。 维生素D主要存在两种形式，分别为维生素D2和维生素D3。对绝大部分人来讲，人体在阳光照射下皮肤中形成维生素D是维生素D3的主要来源，而维生素D2主要存在于各种食物和植物中。这两种维生素D都会在肝脏中被代谢形成25-羟基维生素D（25(OH)D），然后在肾脏中进一步被代谢形成1,25-二羟基维生素D（1,25(OH)2D）[1]。维生素D及其代谢产物主要和血中的维生素D结合蛋白结合，只有0.03%的25(OH)D是以游离形式存在的[1]。由于维生素D和1,25(OH)2D的半衰期相对较短（＜2 d），故系统循环中的25(OH)D被认为是反映人体内维生素D水平的重要指标[1, 4]。人血清中正常的25(OH)D浓度约为10～50 ng/ml，而高浓度的25(OH)D（＞200 ng/ml）可能与毒性和不良的健康状况有关[5]。 2分析25(OH)D的方法 目前有很多不同的分析技术和方法可用于分析人体内的25(OH)D浓度，其中酶免疫分析法曾经是检测血清中25(OH)D浓度的最主要方法，且至今仍在被广泛应用[6]。酶免疫分析法的主要缺陷是抗体之间的交叉反应导致的方法特异性不足，而色谱分析法可对这些分析物进行有效分离，从而获得足够的特异性。在这一方面，液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）法有很大的优势。由于LC-MS/MS法的高选择性、特异性和灵敏度，目前该分析技术已越来越广泛地用于临床检验实验室中对25(OH)D的分析。 3LC-MS/MS法分析人体内25(OH)D的研究现状 鉴于LC-MS/MS法在分析25(OH)D2和25(OH)D3时的独特优势，对近10年内发表的相关英文文献进行搜索，发现采用LC-MS/MS法分析人体内25(OH)D的研究在最近两年内有显著增长。笔者共获得20篇相关英文文献[7~26]，下面就LC-MS/MS法分析人体内25(OH)D的研究作一全面的系统综述和评价，并对影响检测灵敏度和准确度的关键影响因素进行分析。 3.1针对不同人体生物样品的LC-MS/MS法分析策略 大部分研究分析的生物样品均是人血清或血浆，但是有一项研究的分析样品是人的唾液[9]。人唾液中25(OH)D2或25(OH)D3的浓度显著低于血清中的浓度，故对分析的灵敏度提出了更高的要求。这项研究实际上是目前已经报道的最灵敏的分析方法，柱上绝对灵敏度达到了0.7 pg。为了获得高灵敏度，这项研究使用了Cookson试剂（4位取代的1,2,3-三唑啉-3,5-二酮）对25(OH)D进行衍生化反应。25(OH)D2或25(OH)D3本身在电喷雾电离（ESI）下很难被电离，而通过衍生化反应加上一个含丰富N原子的基团后，这一含N基团会使衍生化产物在正离子ESI下很容易形成加氢峰[M+H]+，从而大大提高分析的灵敏度（提高达100倍）。在此基础上，该研究又通过在流动相中加入少量甲胺，使得衍生化产物形成甲胺加合离子[M+CH3NH3]+，后者的形成降低了加氢峰和脱水产物的离子强度，进一步提高了分析的灵敏度。但该研究的样品处理过于复杂。另有两项研究分析的样品是人的干血点[10, 15]。干血点法（DBS）的主要优点是用血量少（如只需3.28 μl全血）、样品容易保存和运输，但对分析的要求也很高。为了保证分析的灵敏度，这两项研究同样采用了衍生化的样品处理方法。 3.2