体外非接触性共培养对MSC向软骨细胞诱导分化实验观察.docVIP

体外非接触性共培养对MSC向软骨细胞诱导分化实验观察[摘要] 目的：探讨骨髓基质干细胞(MSCs)与软骨细胞体外非接触性共培养成软骨的可行性。方法：分离、培养、扩传兔MSCs及软骨细胞，MSCs以1×105个/ml接种于共培养板内孔，第1代软骨细胞以1×104个/ml 接种于共培养板外空板。48 h后将内孔插如外孔中，补充全培养基覆盖于MSC细胞层上。以相同密度MSC单独培养为空白对照，观察共培养7 d和14 d流式细胞仪观察MSC的Ⅱ型胶原蛋白变化情况。结果：实验空白组在7 d和14 d，Ⅱ型胶原蛋白均阴性表达，符合MSC特性。非接触共培养1周后，Ⅱ型胶原蛋白阳性表达，与空白对照比较，P 1.2方法 1.2.1兔MSCs的分离培养用肝素化的无菌注射器抽取骨髓液4~5 ml，淋巴细胞分离法提取MSC，以细胞数1×105个/ml，接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中恒温培养。于第3天取出培养瓶，倒掉细胞悬液(其中含未贴壁细胞)，以后每3～4天换液1次。观察细胞达80%融合后，加入1∶1的2.5 g/L胰蛋白酶和0.2 g/L EDTA混合液，消化，传代，MSCs重新接种至两个75 ml培养瓶中，反复传代、扩增、纯化，传至第4代备用[4]。 1.2.2兔软骨细胞的分离与培养将青紫蓝兔血栓处死，在无菌操作下从其四肢的关节中取出软骨，将软骨切成1～3 mm3大小置无菌试管，PBS冲洗3次，800转/min离心3 min，吸去PBS，加2 g/L胰酶4 ml，CO2孵箱30 min，吸出胰酶后再加入2 g/LⅡ型胶原酶5 ml，置孵箱内消化6～8 h。观察大部分软骨块被消化后，收集消化液，800 转/min离心3 min，用培养液洗2次。细胞记数后移入25 ml培养瓶中，使细胞密度为2×104个/L，加DMEM-F12培养液(含100 ml/L胎牛血清，1×105 U/L青霉素，50 mg/L维生素C，0.15 g/L谷氨酰胺)，于37℃，CO2孵箱中培养，每2天换液1次。原代细胞贴壁并融合成单层后传代培养。 1.2.3 MSCs的鉴定MSCs可以通过流式细胞仪检测特异性抗原CD34、CD45和CD105来鉴定其纯度[5]。使用直接标记法标记CD34和CD45，取细胞悬液到离心管中，1 000转/min离心5 min。用含有1%BSA的无酚红DMEM混匀底部细胞，分别加入单克隆鼠抗兔抗体（抗CD34-PE，抗CD45-PE）和非特异性鼠抗兔IgG-PE，4℃冰箱闭光保存40 min。PBS液洗涤3次，放入流式细胞仪中鉴定，以未标记的细胞设仪器参数，以非特异性鼠抗兔IgG-PE组为阴性对照，记录实验数据。间接标记法标记CD105，在加入一抗为CD105鼠抗兔一抗（稀释1∶100）后，4℃冰箱保存40 min，然后用含有1%BSA的无酚红DMEM洗涤细胞3次，重新用含有1%BSA的无酚红DMEM混匀底部细胞，加入羊抗鼠含荧光标记物FITC的二抗，4℃冰箱闭光保存40 min。PBS液洗涤3次，放入流式细胞仪中鉴定，以未标记的细胞设仪器参数，以非特异性鼠抗兔IgG代替一抗组为阴性对照，记录实验数据。 1.2.4 非接触性共培养取第3代MSCs，以1×105个/ml接种于共培养板内孔，取第1代软骨细胞1×104个/ml 接种于共培养板外空板。48 h细胞扒壁后换液，并将内空插如外空中，补充全培养基覆盖于MSC细胞层上。示意图如图1。共培养7 d和14 d流式细胞仪观察MSC的Ⅱ型胶原蛋白变化情况。无共培养MSC为空白对照组。 间接标记法标记兔Ⅱ型胶原蛋白，在加入一抗为Ⅱ型胶原蛋白鼠抗兔一抗4℃冰箱保存40 min，然后用含有1%BSA的无酚红DMEM洗涤细胞3次。重新用含有1%BSA的无酚红DMEM混匀底部细胞，加入羊抗鼠含荧光标记物FITC的二抗，4℃冰箱闭光保存40 min。PBS液洗涤3次，放入流式细胞仪中鉴定，以未标记的细胞设仪器参数，以非特异性鼠抗兔IgG代替一抗组为阴性对照，记录实验数据。 2结果 2.1细胞形态观察 2.1.1 MSCs培养MSCs呈纺锤形或梭形，原代呈集落样生长，接种后8～10 d 可达80%以上的融合，此时细胞相互间紧密贴附，单个细胞呈狭长梭形，从整体看大多数细胞沿胞体长轴呈有序排列。传代培养后细胞不再以集落方式生长，而是以均匀分布的纺锤形细胞形态平均生长(图2A)。 2.1.2软骨细胞培养各时间段获得的细胞接种后24 h ，只有少量细胞贴壁，48 h后有较多量细胞贴壁，但贴壁不牢，轻轻晃动培养瓶后贴壁细胞容易脱落，72 h后大多数细胞均已贴壁，部分细胞向外伸展，呈椭圆形或多角形，5 d左右细胞形成集落，原代细胞10～12 d