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兔血清白蛋白及IgG分离纯化及鉴定摘要：目的：以兔血清白蛋白和IgG的分离纯化与鉴定实验为例，阐述了血清蛋白制备与分析的过程。方法：使用了硫酸铵分级沉淀、凝胶过滤层析、DEAE离子交换层析、亲和层析、醋酸纤维薄膜电泳、SDS、HPLC等分离纯化鉴定蛋白质的方法。结果：制备了兔血清白蛋白和γ－球蛋白(IgG)，测定被分离物质的相对分子量，鉴定纯化产品的均一性。结论：该实验作为一门生物综合性大型实验，非常有利于培养学生掌握蛋白质制备与分析的综合技能。 关键词：分离纯化；白蛋白；γ－球蛋白；实验 中图分类号：Q503 文献标识码：A 文章编号：1008－2409(2007)03－0424－03 血清白蛋白是人体内重要的营养物质，在血液中有重要生理功能，是血液总渗透压的主要调节物质，其浓度可以反映肝脏的功能，其水平的改变能导致一系列的病理性继发症。血清白蛋白的另一作用是作为脂肪酸的载体参与运送脂肪酸。此外，血清白蛋白还有重要的药用价值，注射白蛋白针剂可治疗浮肿等症。 血清球蛋白是血清蛋白质的重要组成部分，能与外来的特异性抗原起免疫反应而保护机体。检查血清总蛋白及白、球蛋白的比值，即可了解肝脏受损害的程度。总蛋白下降、白／球蛋白比值减少、电泳试验γ－球蛋白增加，是肝炎的常见情况。 因此，测定血清白蛋白常用于患者状态的非特异监视。 1 材料与方法 1．1材料试剂与仪器 1．1．1材料兔血清。 1．1．2 试剂 饱和(NH4)2SO4溶液、磷酸盐缓冲液(pH6.3)、Sephadex G－25、二乙氨乙基(DEAE)纤维素、三氯醋酸、0.5mol／L醋酸铵缓冲液(pH6.5)、0.06mool／L醋酸铵缓冲液(pH6.5)、0.02tool/L醋酸铵缓冲液(pH6.5)、SPA-Sepharose－4B、结合缓冲液(pH8.9)、缓冲液I(pH7.0的PBS)、缓冲液I(pH 3.0的PBS)、Tris-Hcl缓冲液(pH8.5)、柠檬酸溶液(pH3.0)、0.9％NaCI溶液、标准血清白蛋白液、考马斯亮蓝G250等。 1．1．3仪器层析柱，离心机，恒流泵，核酸蛋白检测仪，记录仪，电泳仪，垂直平板电泳槽，微量注射器，Agilent-1100-高效液相色谱仪、紫外可见分光光度计等。 1．2方法 1．2．1血清白蛋白的分离与纯化①硫酸铵盐析法制备粗白蛋白液：取2.0ml兔血清于管中，逐滴加入饱和硫酸铵溶液2.0ml。室温静置10min，3000r／min离心10min。移液枪小心吸出上层清液作为纯化白蛋白之用。②凝胶柱层析获得除盐白蛋白液：Sephadex G-25层析柱以0.02mol／L醋酸铵缓冲液(pH6.5)平衡，以流速1ml／min洗脱粗制白蛋白液获得除盐的白蛋白液。核酸蛋白检测仪在0.05A档、走纸速度6cm／h、100mV，同时记录吸光度值。③DEAE-纤维素离子交换层析柱分离白蛋白：装好的DEAE-纤维索离子交换层析柱以0.02mol／L醋酸铵缓冲液(pH6.5)平衡，将去盐收集得的白蛋白液加到纤维素柱上，接上恒流泵，用0.06～0.5mol／L醋酸铵缓冲液(pH6.5)以流速为1ml／min进行梯度洗脱。核酸蛋白检测仪在0.05A档、走纸速度6cm／h、100mV，同时记录吸光度值。 1．2．2血清．γ-球蛋白的分离与纯化①硫酸铵盐析获得粗制γ-球蛋白液：取2.0ml兔血清于管中，逐滴加入饱和硫酸铵溶液2.0ml。室温静置10min，3000r／min离心10min，用移液枪小心吸出上层清液作为纯化白蛋白之用，沉淀用0.5ml的0.0175mol／L磷酸盐缓冲液(pH6.3)溶解作为纯化γ-球蛋白之用。②凝胶柱层析获得除盐粗制γ-球蛋白液：Sephadex G-25层析柱经0.02mol／L磷酸盐缓冲液(pH6.5)平衡后，0.0175mol／L磷酸盐缓冲液(pH6.3)以流速1ml／min洗脱粗制γ-球蛋白液。核酸蛋白检测仪在0.05A档、走纸速度6cm／h、200mV，同时记录吸光度值。③DEAE-纤维素离子交换层析柱分离γ-球蛋白：将装好的DEAE-纤维素离子交换层析柱先经0.0175mol／L磷酸盐缓冲液(pH6.3)平衡后，在纤维素床面上以流速为1ml／min的0.0175mol／L磷酸盐缓冲液(pH6.3)进行洗脱。核酸蛋白检测仪在0.05A档、走纸速度6cm／h、100mV，同时记录吸光度值。④亲和层析法纯化γ-球蛋白33：用恒流泵，以结合缓冲液平衡柱，流速为0.5ml／min。将DEAE-纤维素离子交换层析后的γ-球蛋白溶液上柱，用结合缓冲液洗柱。依次分别用5倍床体积的缓冲液I～I洗脱(流速0.5 ml／min)，缓冲液I