啮齿类小鼠γ-干扰素原核表达、纯化及功能鉴定.doc

啮齿类小鼠γ-干扰素原核表达、纯化及功能鉴定[摘要] 目的：构建γ-干扰素的高效原核表达载体，进行γ-干扰素表达、纯化和鉴定，并探索优化啮齿类γ-干扰素的制备工艺。方法：用RT-PCR技术，从ConA活化的小鼠脾细胞中扩增出mIFN-γcDNA，与原核表达载体pET30a(+)重组，表达和纯化重组蛋白His6-mIFN-γ，并用Western Blot检测该重组蛋白的生物学活性。结果：构建了啮齿类γ-干扰素的高效原核表达载体，并实现了γ-干扰素的可溶性表达，且验证该γ-干扰素具有生物学活性。结论：成功优化了生产干扰素的工艺，为国内外进行γ-干扰素研究奠定基础。 [关键词] γ-干扰素；原核表达；纯化 [中图分类号] TQ929+.1[文献标识码]A[文章编号]1673-7210（2008）01（a）-011-03 Prokaryotic expression and purification of murine interferon-gamma LIU Xiao-hui, CHEN Zhuo-jia, DU Jun (Department of Microbiology and Biopharmaceutics in School of Pharmaceutical Sciences,Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080，China) [Abstract] Objective:To clone murine interferon-gamma gene, do effective prokaryotic expression and purify recombinant murine IFN-γ for further study.Methods:To amplify mIFN-γcDNA from ConA-activated murine splenocytes by RT-PCR and clone into pET30a(+) vector．Then the target protein His6-mIFN-γ was induced by IPTG and purified with Ni2+-NTA agarose. The biologic activity was identified by western blotting.Results:The prokaryotic expression system of mIFN-γ was constructed．And the fusion protein mIFN-γ was dissoluble and bioactive.Conclusion:The technology of mIFN-γ production is successfully optimized. It lays a foundation of further research of IFN-γ． [Key Words] IFN-γ；Prokaryotic expression；Purification 英国国立医学研究所的Isancs和Lindenman在研究病毒的干扰现象时发现了一种可溶性物质，进一步研究表明这一物质能够抑制多种病毒在细胞内的繁殖，于是将其命名为干扰素（interferons，IFN）[1]。干扰素是一类由低分子可溶性蛋白组成的重要细胞因子，自1957年Isancs首次发现鸡干扰素以来，先后已有人、鼠、犬以及猪等动物的干扰素基因被成功克隆。IFN-γ具有很强的抗病毒活性、免疫调节活性和抗肿瘤活性。IFN-γ可通过多种途径来发挥抗肿瘤作用，既通过延长细胞周期以延缓肿瘤细胞的生长和繁殖；又可通过抑制癌基因的表达来阻止或减慢肿瘤细胞的转化过程；还可诱导肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)上调癌细胞对TNF受体、MHCⅡ类抗原等的表达，使其易被杀伤性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)识别而被杀伤[2]。 当病原体侵入机体组织后，淋巴细胞在感染部位聚集并释放干扰素等细胞因子。IFN-γ主要通过JAK-STAT途径来发挥作用的。IFN-γ与几乎分布于所有正常细胞表面的高亲合力的受体IFN-γR（IFNGR）结合并使受体发生二聚化后，受体的胞内近膜区可与胞浆内非受体TPK-JAK激酶(janus kinase)结合并发生磷酸化，进而与信号转导和转录激活因子1(signal transducers and activators of transcription，STAT-1)相结合。在JAK催化下，STAT-1结合成