大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌高产AmpC β-内酰胺酶菌株中染色质ampC共同序列探究.doc

大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌高产AmpC β-内酰胺酶菌株中染色质ampC共同序列探究摘要：目的：旨在通过分子生物学检测方法研究大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中染色质ampC的共同序列。方法： 样本来源于我院和无锡中医医院2010年1月至12月间感染患者分泌物中提取的革兰氏阴性杆菌，大肠埃希菌32株和肺炎雷伯菌12株，DNA提取、PCR扩增、转化接种、琼脂平皿、孵育、接种、震荡后过夜、提取出重组质粒，并使用对应的ampC基因实施PCR，鉴定重组子插入片段的长度。结果：27株细菌染色质ampC产物经电泳处理，有27株可见唯一清晰条带状，1100bp左右，大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的阳性率分别为53.13%和83.33%。大肠埃希菌的染色质ampC同源性较高，达92.8%，而肺炎克雷伯菌的同源性相对较低，为75.2%。结论：具有高同源性的大肠杆菌的菌种特异性ampC引物可作为一种检测ampC存在的重要依据，但针对于肺炎克雷伯菌相对较低的同源性，该检测的有效性仍需进一步深入研究和探讨。 关键词：大肠埃希菌，肺炎克雷伯菌，染色质，共同序列 【中图分类号】R446.5【文献标识码】A【文章编号】1672-3783(2012)02-0277-01 随着临床药学研究的不断深入，激素类、免疫抑制类、抗菌类等药物已经被广泛应用于临床，并不断的有新型药物出现。但由于侵入性治疗越来越多，感染加剧，各类β-内酰胺酶引发的细菌耐药性问题日益显现，尤其是产AmpC β-内酰胺酶（以下简称AmpC酶）产细菌耐药性明显，给临床治疗带来很大难度。ampC是AmpC染色质或质粒上的结构基因，其对AmpC酶的产生有决定性作用。目前对于不同类型产酶细菌上染色质ampC同源性尚不明确，本文旨在通过分子生物学检测方法研究大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中染色质ampC的共同序列。 1材料与方法 1．1样本菌种:样本来源于我院和无锡中医医院2010年1月至12月间感染患者分泌物中提取的革兰氏阴性杆菌，采用法国生物梅里埃微生物实验室提供的VETEK鉴定到种，并得选出具有高产AmpC酶的大肠埃希菌32株和肺炎雷伯菌12株。 1．2试剂:采用由Sigma公司提供的细菌染色质DNA抽提试剂盒，由博大泰克公司生产的PCR产物纯化试剂盒，由Takara公司生产的聚合酶反应（PCR）扩增试剂盒，由天根公司提供的感受态细胞DH5α和100bp DNA ladder，各试验阶段的操作方法按试剂盒相关说明进行。 1．3试验方法:参照试剂盒分别对两种试验细菌染色质进行DNA提取，并进行PCR扩增，取PCR产物片段与pMD19-T载体相连，转化接种，琼脂平皿，室温中孵育过夜。对单个白色菌落进行编号，接种、震荡后过夜，次日提取出重组质粒，并使用对应的ampC基因实施PCR，鉴定重组子插入片段的长度。PCR反应体系及扩增条件如同前述，扩增后出现约为1.1kb的DNA片段的克隆可能包含目的ampC基因，认定为阳性克隆。进行重组质粒插入片段的测序采用DNAsis V2.9进行共同序列的比对，筛选出各类细菌的共同序列，取具有特异性部分作为目的片段，设计PCR引物。引物验证采用双盲法，利用设计菌种的特异性PCR引物分别对50株大肠埃希菌和43株肺炎克雷伯菌ampC基因进行扩增。 2结果 如表1，27株细菌染色质ampC产物经电泳处理，有27株可见唯一清晰条带状，1100bp左右，大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的阳性率分别为53.13%和83.33%。 10同源性 92.8% 75.2% 如表2，大肠埃希菌的染色质ampC同源性较高，达92.8%，而肺炎克雷伯菌的同源性相对较低，为75.2%。 3讨论 AmpC酶主要由肠杆菌科细菌等所产生的，其作用于头孢菌素类抗菌类药物，并不受克拉维酸的抑制影响。AmpC酶主要介导方式来源于染色质，少量来源于质粒，而染色质或质粒的结构性基因，即ampC则决定了AmpC酶的产生。目前国内外已经有一些相关于AmpC酶分子生物学的检测方法，给临床感染耐药性的相关研究提供了有力依据和方法。该方法利用PCR的扩增作用，快速有效的扩增ampC基因，便宜于通过简单的琼脂糖凝胶电泳处理来更加的显示出染色型或质粒型ampC基因存在情况，从而判断和确定细菌的耐药机制以及产酶的实体类型。 ampC基因在耐药质粒中显示出持续高产的状态，刺激了原本不存在AmpC产出能力的细菌菌株也利用耐药质粒获取AmpC酶的高产能力，加重了细菌对某粒药物的耐受程度，日久则对临床治疗产生了明显的延缓和影响。PCR是目前检测质粒型ampC的权威指标，被广泛应用，这也使ampC基因同源性的研究具有了更多的依据和渠道。本组研究中，大肠埃希菌的染色质ampC同源性相对较高，为