无精子症及少精子症不育患者Y染色体AZF微缺失检测.docVIP

无精子症及少精子症不育患者Y染色体AZF微缺失检测【摘 要】 目的:探讨无精子症和少精子症患者Y染色体AZF微缺失与男性不育的关系。方法:采用多重PCR技术和毛细管电泳，对167例无精子症和少精子症患者进行Y染色体AZF微缺失检测，并以50例已生育的正常男性和10例正常女性作对照。结果:167例无精子症和少精子症患者中共发现AZF微缺失11例，总缺失率6.59%（11/167），其中无精子症患者65例，AZF微缺失4例，缺失率6.15%（4/65）；严重少精子症患者50例，AZF微缺失7例，缺失率14.00%（7/50）。52例少精子症患者和50例已生育正常男性均未发现AZF微缺失。AZF微缺失的缺失类型及比例：AZFc缺失 10例，占总缺失的90.91%(10/11)；AZFb+c缺失 1例，占总缺失的9.09%(1/11)，11例缺失患者中未发现AZFa缺失。结论:染色体AZF微缺失是引起生精功能障碍导致男性不育的主要原因之一，AZF微缺失主要集中在无精子症和严重少精子症患者中，以AZFc缺失为主。 【关键词】Y染色体; 无精子因子; 微缺失; 男性不育; 聚合酶链反应; 毛细管电泳 据报道，育龄夫妇中约15%患有不育，其中由男性因素引起的不育约占这一比例的50%。引起男性不育的病因有多种，较常见的有感染性、器质性和遗传缺陷等病因。但是，到目前为止，仍有约30%男性不育的病因尚不清楚，而他们共同的临床表现是无精和少精。对Y染色体上基因的研究发现，Y染色体长臂q11区域存在与精子发生相关的基因，称无精子因子(azoospermia factor AZF)，AZF发生微小缺失可引起生精功能障碍，造成无精子或少精子，导致男性不育[1]。目前，还没有治疗Y染色体AZF微缺失的办法。部分AZF微缺失不育患者可借助卵细胞浆内单精子注射（ICSI）辅助生殖技术而生育后代，但有把Y染色体AZF微缺失这种缺陷遗传给男性后代的风险。因此开展Y染色体AZF微缺失检测，对男性不育患者特别是无精子症和少精子症不育患者的诊断和治疗有重要的临床意义，国内外多数生殖医学中心均开展AZF微缺失检测，但由于检测方法和检测对象选择的不同使检测结果有较大的差别。本研究运用毛细管电泳技术与传统的琼脂糖凝胶电泳对Y染色体上AZF区域6个序列标签位点的PCR扩增产物进行电泳分离，分析AZF缺失结果，旨在探讨Y染色体AZF微缺失与男性不育的关系，为无精子症和少精子症不育患者的诊断和治疗提供依据。 1 材料与方法 1.1 材 料 检测对象：2006年6月到2007年11月期间，在我院生殖不孕中心与生殖健康科就诊的无精子和少精子患者167例，年龄23~46岁。按照WHO推荐的标准分类[2]：连续两次精液检查，精液标本经离心沉淀未发现精子者为无精子症；精子密度小于5×106/ml者为严重少精子症；精子密度小于20×106/ml者为少精子症。167例患者中无精子症65例，严重少精子症50例，少精子症52例，均排除精索静脉曲张、输精管阻塞、染色体核型异常和泌尿生殖道感染等情况。并以50例已生育的正常男性和10例正常女性作对照。受试者用真空肝素抗凝管抽取外周静脉血2mL待测。 主要仪器：美国ABI公司3100-ADVANT毛细管电泳分析仪； 北京六一电子厂生产的DYY-8C型电泳仪； 美国UVP凝胶扫描系统； 精子动静态特征图象自动分析系统。 软件：美国ABI公司随仪器提供软件：Data Collection 1.0和GeneScan 3.7。 主要试剂：提取血液基因组DNA试剂盒QIAamp?? DNA Blood Mini Kit由QIAGEN公司提供； 毛细管电泳仪检测使用的耗材及试剂均购自美国ABI公司； Premix Taq购自大连宝生物工程有限公司； 常规检测对照方法使用深圳亚能生物技术有限公司的Y染色体AZF微缺失检测试剂盒。 Y染色体AZF微缺失检测选择的6个STS位点：SY84、SY86、SY127、SY134、SY254和SY255。 2 方法 2.1 DNA的提取检测对象血液样本均用QIAamp?? DNA Blood Mini Kit试剂提取DNA。操作完全按说明书进行。 2.2 多重PCR反应体系的设置94℃预变性5min，94℃变性30sec，54℃退火30sec，65℃延伸1min，共进行28个循环，60℃延伸60min；温度降到25℃后结束反应。每次PCR实验均设如下三个质控：①不含DNA的AE缓冲液(QIAamp?? DNA Blood Mini Kit内附)作为试剂空白对照；②正常女性血液样品提取的DNA作为扩增体系阴性对照；③正常生育男性