Feulgen-Rossenbeck 改良DNA法.pptVIP

Feulgen-Rossenbeck改良的DNA法;脱氧核糖核酸通过盐酸水解，第一步从DNA的脱氧核糖核酸残基分解出碱基，第二步在脱氧核糖残基的第1～4位碳键处打断糖苷键而游离出醛基，游离出来的醛基即与无色复红液（Schiff试剂）反应形成紫红色的复合物而把DNA显示出来。Schiff试剂配制 同PAS反应; 操 作 步 骤 ;结果 DNA呈紫红色，胞质呈浅绿色。 注意事项 ① 新鲜组织染色效果较好。 ② 以Carnoy液固定的组织染色效果较好。 ③ 最佳水解时间随所用固定方法而异。如用无水乙醇固定，水解时间为5min，如用Carnoy液固定则水解时间为8min。 ④ 在配制Schiff试剂时，要求活性炭质优而量少，每100mlSchiff试剂应少于300mg，接触时间不得超过2min，以免被SO2漂白；用布氏漏斗、粗滤纸或玻璃丝快速过滤。 ;⑤ 1NHCl应预热到60℃。 ⑥ 有些碱性复红含杂质太多，亚硫酸氢盐不能使复红脱色，不能用于配制Schiff试剂。 ⑦ 偏重亚硫酸盐如保管不佳，潮解或硫味不足，则不能使复红脱色。 ⑧ 盛Schiff试剂的瓶子不宜过大，避免SO2逸出而留在瓶内无液体的空间。 ⑨ 要特别注意Schiff试剂贮存过程中SO2的丧失及试剂PH值改变。染色深度（及其分光性质）严格取决于所用试剂的PH值。 ;过碘酸-Schiff反应;染色过程 ① 组织切片，脱蜡至水； ② 蒸馏水洗； ③ 入过碘酸氧化液10～20min； ④ 充分蒸馏水洗； ⑤ Schiff液染色10min（如果室温在15℃以下可稍加温以加快反应）； ⑥ 流水冲洗10min（对着色较深颜色的切片可缩短时间）。 ⑦ 可用Mayer明矾苏木素液染核3～5min； ⑧ 0.5%盐酸乙醇分化； ⑨ 无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。;结果 PAS反应阳性产物呈红色，细胞核蓝色。 注意事项 ① 为避免多糖类物质溶解，不用水溶性固定剂。对于糖原的 固定，则需选用Carnoy等固定液。 ② 偏重亚硫酸钠需质量优良，不能使用陈旧无硫的刺激性气 味的药品。 ③ 染了Schiff液后，不可用自来水冲洗过久，防止返红。应 注意切片变红适中后立即封片。 ; Feulgen 反应显示脱氧核糖核酸 （1）原理；脱氧核糖核酸经1N盐酸在60℃水解，破坏嘌呤和脱氧核糖之间的配糖键而形成醛基，再与无色的Schiff试剂结合使其还原，形成具有醌结构的红紫色化合物即脱氧核糖核酸（DNA）。 （2）操作步骤： 1)取2~3毫米厚的组织块，固定于Carnoy或10% 甲醛等液均可。 2)石蜡切片、脱蜡至水。 3)入1N盐酸60℃ 60分钟水解。 1N盐酸的配制：用比重1.19浓盐酸82.5毫升，加蒸馏水到1000毫升即成。 盐酸水解的时间，随所用的固定剂不同而别。（见Bauer表） 4)蒸馏水洗。 5)入Schiff氏试剂中反应30分钟至1小时。 取0.5克碱性品红（Basic uchsin）溶于100毫升煮沸的蒸馏水（用三角烧瓶）时时摇荡，煮5分钟，使之充分溶解。冷至50℃时过滤加10毫升1N盐酸。冷至25℃时加0.5克偏重亚硫酸钠或钾或无水亚硫酸氢钠，放入棕色瓶于暗处静放24小时，有时需2~3天，应由紫红色变为淡黄色，置于暗处，密封瓶口，冰箱内可保存数月。若24小时后颜色过深可加活性炭0.5克摇匀脱色1分钟，用粗纸滤过保存。 6)切片用自来水洗，洗去多余的染液。冲洗前切片呈淡红色，冲洗后颜色可以加深。 7)脱水、透明、树胶封片。 （3）结果：DNA呈紫红色。;（4）注意事项 1) 新鲜组织染色效果较好。 2) 以Carnoy液固定的组织染色效果较好。 3) 最佳水解时间随所用固定方法而异。如用无水乙醇固定，水解时间为5min，如用Carnoy液固定则水解时间为8min。 4) 在配制Schiff试剂时，要求活性炭质优而量少，每100mlSchiff试剂应少于300mg，接触时间不得超过2min，以免被SO2漂白；用布氏漏斗、粗滤纸或玻璃丝快速过滤。 5)1NHCl应预热到60℃。 6) 有些碱性复红含杂质太多，亚硫酸氢盐不能使复红脱色，不能用于配制Schiff试剂。 7) 偏重亚硫酸盐如保管不佳，潮解或硫味不足，则不能使复红脱色。 8) 盛Schiff试剂的瓶子不宜过大，避免SO2逸出而留在瓶内无液体的空间。 9) 要特别注意Schiff试剂贮存过程中SO2的丧失及试剂PH值改变。染色深度（及其分光性质）严格取决于所用试剂的PH值。 ;