基因克隆技术在葡萄研究中的应用.docVIP

基因克隆技术在葡萄研究中的应用 （西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西杨凌 712100） he application of gene cloning in study of grape SONG Chang-zheng (College of Enology, Northwest A﹠F University, Yangling, Shaanxi 712100, China)Abstract：we summarized the application of gene cloning in study of grape from the following points: tools of gene cloning and the optimizing of the study, the use of gene cloning in sequence analysis, cloning and expressing of the relevance genes in grape production, structure of other organisms with genes from grape, challenge of transgenosis and solution. Furthermore we discussed related issues and had a look into the distance. Key words: gene cloning; grape; application 引言 葡萄是世界主栽果树之一，产量仅次于柑桔位居第二。世界年生产葡萄的80％用来酿酒，16％鲜食，4％制干(王华和张继澍. 2003)。多年来各葡萄生产国政府和科研工作者均十分重视葡萄的生产和科研工作。 基因的克隆技术是生命科学研究的重要组成部分，是现代生命科学技术中最核心的内容，它是随着20世纪70年代初DNA体外囊组技术的发明而发展起来的，其目标是识别和分离特异基因并获得基因完整序列，确定其在染色体上的位置，阐明其生化功能，并利用生物工程手段应用到生产实践(陈儒钢, 巩振辉等. 2009)。 目前基因克隆技术包括功能克隆，定位克隆，转座子标签法，抑制性差减杂交，同源序列法，基因芯片，电子克隆等(陈儒钢, 巩振辉等. 2009)，每种克隆技术都有特有的功能用途。随着生物技术的飞速发展，人们越来越多地把目光投向具有商业价值的转基因植物。葡萄遗传中已有许多可以利用的目的基因，越来越多的目的基因已被克隆测序分析，或者导入葡萄中。同时，葡萄基因组中的一些基因也被作为目的基因转入其它生物（如酿酒酵母及其他作物）中。 克隆工具及相关方案研究 在常规的基因克隆过程中常见工具包括引入外源DNA的工具，稳定转基因DNA的工具，选择标记，以及合适的启动子、终止子等(Schuller and Casal.2005)。 引入DNA的工具即载体，目前已经有一系列构建的穿梭载体用于促进目的基因在工程酵母中的表达。被引入的载体必须具有在转化菌株中自我复制的能力并能传递给后代。目的基因在重组菌株中可以通过载体的自我复制或者与宿主基因组整合而得到稳定(Schuller and Casal 2005; Fang, Salmon et al. 2011)。 通常是通过标记基因编码可以催化解毒的活性酶，或者是让菌株发生对抗生素不敏感的突变,从而达到筛选重组菌株的功能。在将葡萄中的目的基因克隆转化到酿酒酵母的研究也有很多，在构建工程酵母过程中的标记基因，包括隐性，半显性，显性标记(Cebollero, Gonzalez-Ramos et al. 2007)。隐性基因如URA3或者LEU2最为普遍。然而，因为酿酒酵母菌株通常都是原养型的，这些标记基因都不能被使用。相比之下，显性或者半显性选择标记的优点在于可以应用于任何菌株。例如，环己酰亚胺抗性基因，一个编码突变体核糖体蛋白L29的半显性标记(Pérez-González, González et al. 1993)；使用更多的还有用于工业酿酒酵母转基因的G418抗性基因(Wach, Brachat et al. 1994)。 在植物转基因过程中，通常两种标记基因也要引入：允许进行细胞筛选的选择基因和可供观察转基因发生的报告基因。较多使用的选择基因有新霉素磷酸转移酶基因(nptII)，对应抵抗卡那霉素；潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)，抵抗潮霉素以及氨基转移酶，赋予除草剂抗性。uidA编码的葡萄糖醛磷酸酶被广泛用作报告标记，但是有破坏分析成分的缺点。因此，水母绿色 荧光蛋白成为了最受欢迎的可视化标记(Vidal, Gomez et al. 2010)。 在大多数情况下，为了让目的基因尤其是异源基因在宿主体内较好